试验设计

 采集8个健康成人志愿者的新鲜粪便制得粪便提取物（FE），分别向具塞试管中加入2.50 mL含10 g/L底物（抗性淀粉、XOS、菊糖）的碳酸盐-磷酸盐缓冲溶液、2.50 mL粪便提取物和0.50 mL无菌去离子水，混匀后发酵24 h和48h（37 °C，厌氧），通过离心，得到上清液，分成两部分，分别用于有机酸分析和细胞实验。

 选用10株乳酸菌，分别是嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lb. bulgaricus）、短乳杆菌（Lb. brevis）、干酪乳杆菌（Lb. casei）、发酵乳杆菌（Lb. fermentum）、植物乳杆菌（Lb. plantarum）、 鼠李糖乳杆菌（Lb. rhamnosus)、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、粪肠球菌（E. faecalis）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），进行添加外源乳酸菌发酵试验，即用乳酸菌培养液等量替代试管中的无菌去离子水，其它成分及含量不变，按照上述步骤进行发酵及后续处理。

 有机酸分析：采用气相色谱法测乙酸、丙酸和丁酸3种短链脂肪酸；采用分光光度法测定乳酸。

 细胞实验：以人结肠癌细胞系HCT-116为研究对象，在含10%（v/v）发酵产物的细胞培养基进行培养，通过酶标仪测定各孔吸光值（OD），计算细胞的增殖抑制率；采用DNA-Ladder鉴定细胞凋亡；使用流式细胞仪分析细胞凋亡。

试验结果

（1）未添加外源乳酸菌时的发酵产酸

 如表1所示，比较各膳食纤维与粪便提取物自身的有机酸产生情况，可以发现，抗性淀粉、XOS和菊糖发酵产物中4种有机酸的含量均大幅度提高，当底物为XOS时，发酵24 h，产物中四种酸的含量分别是32.44 mmol/L，1.79 mmol/L，11.27 mmol/L和0.29 mmol/L；长期发酵（48 h）产生更多的乙酸（42.31 mmol/L）、丙酸（3.53 mmol/L）和丁酸（13.95 mmol/L），乳酸的含量减少到0.19 mmol/L。比较3种膳食纤维体外发酵产酸情况，XOS发酵产生较多的乙酸和丁酸。

（2）添加外源乳酸菌后XOS的发酵产酸

 如表2所示，添加乳酸菌后，XOS发酵产物中有更多的短链脂肪酸产生，且48 h发酵产物中的短链脂肪酸含量高于24 h发酵产物中的短链脂肪酸含量；与未添加乳酸菌时发酵产酸比，添加短乳杆菌（Lb. brevis）和发酵乳杆菌（Lb. fermentum）减少了乙酸和丁酸的生成，其它发酵产物中的乙酸和丁酸含量增加，其中，发酵24 h，乙酸和丁酸分别增加10% ~ 54%和6% ~ 71%；发酵48 h，两种酸分别增加4% ~ 40%和5% ~ 119%；发酵产物中的乳酸含量受发酵时间影响，乳酸主要产生于0 ~ 24h的发酵阶段，含量达到0.89 ~ 3.24mmol/L，24 ~ 48h发酵阶段降低了乳酸含量（0.26 ~ 2.46mmol/L）；在24 h发酵产物中，添加嗜酸乳杆菌（Lb. acidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lb. bulgaricus），植物乳杆菌（Lb. plantarum）和嗜热链球菌（S. thermophilus），使得产物中丁酸增加较多（高于16 mmol/L）；在48 h发酵产物中，添加嗜酸乳杆菌（Lb. acidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lb. bulgaricus）、干酪乳杆菌（Lb. casei）和植物乳杆菌（Lb. plantarum）会产生更多的丁酸（高于24 mmol/L）。

（3）XOS发酵产物的增殖抑制作用

 如表3所示，未发酵的XOS对细胞的增殖抑制作用只有24.5%，XOS被粪便提取物中的微生物发酵后，发酵产物对细胞的增殖抑制作用增加到66.2% ~ 67.5%，明显高于粪便提取物自身发酵产物对细胞的增殖抑制作用（35.2% ~ 37.6%）（P<0.05）。添加乳酸菌培养液后，发酵产物普遍表现出较强的增殖抑制作用，增殖抑制率变化幅度为63.4% ~ 82.4%，并且48 h发酵产物对细胞的增殖抑制作用高于24 h发酵产物（69.4% ~ 82.4% vs 63.4% ~ 82.0%）。此外，不同的乳酸菌会在不同程度上影响发酵产物对HCT-116细胞的增殖抑制作用，其中，Lb. casei与粪便提取物共同发酵XOS 48 h所得产物对细胞增殖抑制作用最大（82.4%）。

（4）DNA-Ladder分析结果

 如图1所示，所评估的9种发酵产物均能诱导HCT-116细胞产生凋亡，形成细胞凋亡特征性的 DNA Ladder；在每张电泳图中，抑制率最高的产物P3所对应的条带5均显示出最明亮的条带，而抑制率低的产物P1所对应的条带3相对较暗。DNA Ladder实验结果初步证明：（1）膳食纤维发酵产物均能够诱导HCT-116细胞发生凋亡；（2）发酵产物的增殖抑制作用高，诱导细胞凋亡作用大。

（5）XOS发酵产物的凋亡诱导作用

 如图2所示，阴性对照组（Control）中细胞凋亡较弱，早期凋亡和晚期凋亡细胞比例分别是5.3%和4.4%；XOS-P1、XOS-P2和XOS-P3均能诱导HCT-116细胞发生凋亡，凋亡细胞数明显增多。XOS-P1、XOS-P2和XOS-P3作用48 h后，在细胞凋亡早期，凋亡细胞比例分别为26.9%、29.2%和33.2%；在细胞凋亡晚期，凋亡细胞比例分别为12.6%、18.6%和23.5%。

（6）各个产物凋亡诱导作用的比较

 如图3所示，细胞经XOS-P1、XOS-P2 和XOS-P3处理后，总凋亡细胞比例为39.5% ~ 56.7%，明显高于抗性淀粉组（16.9% ~ 47.8%）和菊糖组（17.9% ~ 39.6%），菊糖组对细胞的凋亡诱导作用较弱。联系发酵产物对细胞的增殖抑制作用发现，XOS-P1、XOS-P2和XOS-P3对细胞的增殖抑制率相对较高（63.4%~82.4%），综合分析，认为添加乳酸菌后所得的XOS发酵产物具有较强的抗结肠癌活性。

试验结论

 本文研究了外源乳酸菌对XOS体外发酵产物抗结肠癌活性的影响，利用健康成人粪便提取物作为肠道菌群来源，模拟肠道实际环境（37 °C，厌氧）进行体外发酵，分析有机酸产生情况，结果显示，XOS发酵可以产生较多的乙酸和丁酸；再评估添加外源乳酸菌对XOS发酵产酸的影响，在外源乳酸菌的影响下，XOS发酵产生更多的乙酸和丁酸；然后评估外源乳酸菌对发酵产物对人结肠癌细胞HCT-116的增殖抑制作用和凋亡诱导作用的影响，通过对比3种不同膳食纤维对细胞增殖抑制率和凋亡诱导作用的差异，综合分析，认为添加乳酸菌后所得的XOS发酵产物具有较强的抗结肠癌活性。以上结果表明，添加乳酸菌后XOS发酵可以产生较多的短链脂肪酸，具有较强的抗结肠癌活性。

参考资料：

殷丹婷. 外源乳酸菌对膳食纤维体外发酵产物抗结肠癌活性的影响[D].东北农业大学, 2017.