试验设计

 原料：低聚木糖；番泻叶。

 番泻叶提取物的制备：将番泻叶用中药机打碎，用网筛过筛；将番泻叶粉末在100℃的水中浸泡10分钟，液料比例为5：4，然后将浸泡液以8000×g离心10分钟，在4℃下保存，这相当于0.8 g mL^-1的粗制药物。

 小鼠实验的分配和剂量信息：KM小鼠在特定无病原体（SPF）条件下饲养，适应喂养一周后将小鼠随机分为五组，每组8只小鼠。实验过程如图1所示。对照组每天喂食200 μL生理盐水（D8-D42）；模型组喂食200 μL生理盐水（D8-D28）和番泻叶提取物（D29-D42）。而三个XOS组口服200 μL不同浓度的XOS溶液（D8-D28）和番泻叶提取物（D29-D42）。口服XOS的浓度为0.25、0.50和1.00 mg g^-1 BW day^-1。在实验过程中，每周测量体重。

 腹泻指数的测定：通过统计每只小鼠的稀便次数、总稀便次数和稀便等级来计算腹泻指数。稀便率=稀便总数/大便总数。腹泻指数=稀便率×平均稀便程度（根据滤纸染色直径分为0-4级；1级：染色直径<1厘米，2级：染色直径为1-1.9厘米，3级：染色直径为2-3厘米，4级：染色直径>4厘米）。

 肠道推进试验的测量：在实验中，每组随机选择4只小鼠进行小肠推进试验。实验的第45天，在单笼中随机选择每组4只小鼠。实验前小鼠禁食12小时，并喂以0.4毫升酚红溶液（0.04%）。间隔30分钟后，杀死小鼠并收集从胃到回盲部交界处的片段。酚红推进率（%）=酚红的迁移距离/小肠全长×100%。

 结肠组织学的评估：收集新鲜的结肠组织，并在多聚甲醛溶液中固定48小时，分别用酒精和石蜡脱水和包埋。然后将结肠切片，用苏木精和伊红（H&E）进行染色，用倒置显微镜观察结肠病理。

 结肠组织中细胞因子和D-乳酸（D-LA）水平的测定：白细胞介素（IL）-6、IL-10、TNF-α,、血管生成素（Ang1）和D-LA的浓度用市售的ELISA试剂盒测量，结肠组织用磷酸钾缓冲液（1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒）匀浆，在4℃下12000×g离心20分钟。采用BCA法用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。

 紧密连接（TJ）蛋白的测定：通过免疫组化和ELISA方法测定闭锁蛋白和ZO-1的浓度。为了进行免疫组化分析，将福尔马林固定的结肠组织处理后切片，组织切片用苏木精进行反染色，用显微镜对组织切片进行研究。对于ELISA分析，用市售的ELISA试剂盒测量结肠组织上清液中的闭锁蛋白和ZO-1的浓度，用磷酸二氢钾缓冲液匀浆，4℃下12000×g离心20分钟；用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。

 SCFAs的测定：在第43天收集每只小鼠排泄的新鲜粪便样品，冷冻并储存在-80℃。将50 mg粪便样品加入500 μL 0.9%NaCl溶液中，用40 μL 10%H₂SO₄进行酸化。加入1 mL二乙醚后，将溶液剧烈摇晃30分钟。然后，通过在4℃下以12000×g离心混合溶液20分钟，在二乙醚相中获得SCFAs。最后，用GC-MS方法测定SCFAs。

 16S rRNA基因测序和生物信息学分析：使用FastDNA Spin Kit for Feces（MP Biomedicals, LLC, Irvine, CA, USA）提取粪便样品的DNA。通过引物对（341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；806R：5′GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）扩增16S rRNA测序基因（V3-V4）。随后，使用Qiagen凝胶提取试剂盒（Germantown, MD, USA）对混合PCR产物进行纯化。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（SanDiego, CA, USA）将所有的样本汇集起来，制备测序文库。库的质量用Agilent 2100生物分析仪测量。最后，在Illumina HiSeq 2500平台上对文库进行测序，并产生250 bp的成对末端读数。

试验结果

（1）XOS对小鼠生理观察的影响

 在喂食实验中，小鼠从第8天到第28天口服补充XOS，然后从第29天到第42天服用番泻叶提取物。模型组小鼠经过14天的番泻叶提取物处理后出现了腹泻症状，说明腹泻模型的建立是成功的。

 如图2A所示，体重随着番泻叶提取物的摄入而下降。在模型组中，与小鼠的初始体重相比，体重下降了11.5%。然而，对照组小鼠的体重没有显示出明显的差异。不同浓度的XOS干预在改善体重下降方面发挥了类似的作用，而0.50 mg g^-1 BW day^-1的XOS能显著改善体重。

 如图2B所示，试验结束时，模型组的DAI评分为1.210，说明XOS的干预对DAI评分有缓解作用，0.25和0.50 mg g^-1 BW day^-1剂量XOS干预组的腹泻指数分别为1.038和1.059（pX-M<0.05，pX-H<0.05）。

 如图2C所示，与模型组（91.94%）相比，0.25 mg g^-1 BW day^-1 XOS组的胃肠道推进力显著下降到76.71%。

（2）XOS对结肠组织的组织病理学和炎症细胞因子的影响

 如图3A所示，在对照组的结肠组织中，没有糜烂和溃疡的形成，隐窝结构正常且相对完整。但是，有大量的炎症细胞浸润和肠绒毛结构损伤。模型组的病理炎症程度显著高于对照组。重要的是，XOS治疗后，肠绒毛结构的损伤程度和免疫细胞的浸润都得到了改善。

 如图3B-3D所示，与对照组相比，模型组的TNF-α有所增加。模型组的TNF-α增加了45.70%。图3B显示，XOS的干预可以抑制TNF-α的浓度，尤其是1.00 mg g^-1 BW day^-1的XOS处理。图3C显示，模型组的抗炎因子IL-10比对照组减少了34.30%，而1.00 mg g^-1 BW day^-1 XOS处理后，IL-10的浓度增加了34.80%。此外，图3D显示，与对照组相比，模型组的Ang1下降，而0.50 mg g^-1 BW day^-1 XOS处理后，Ang1的浓度显著增加41.67%。

（3）XOS对肠道屏障的影响

 如图4A所示，模型小鼠血清中的D-LA显著高于对照小鼠，增加了1.23倍。血清中D-LA的浓度随着XOS的干预处理而下降，特别是0.50 mg g^-1 BW day^-1的XOS干预处理使D-LA的浓度下降48.3%。

 如图4B-4D所示，模型组的ZO-1和闭锁蛋白的平均光密度低于对照组。而用XOS的干预处理减弱了破坏的模式，并显著扭转了ZO-1和occludin蛋白的表达变化。与对照组相比，腹泻模型组的TJ蛋白浓度显著下降，ZO-1和occludin蛋白的浓度分别只有30和20 pg mg^-1蛋白。虽然通过不同剂量的XOS干预，肠道屏障得到了改善，但TJ蛋白的浓度却有不同的改善。值得注意的是，0.50 mg g^-1 BW day^-1的XOS干预治疗使ZO-1和occludin的浓度分别增加了89.6%和90.7%。总的来说，0.50 mg g^-1 BW day^-1的XOS发挥了最显著的肠道屏障保护作用。

（4）XOS对SCFAs的影响

 由表1可知，在XOS干预治疗组与对照组和模型组之间，SCFAs的总浓度和单个浓度是不同的。乙酸（57-106 μmol g^-1）是小鼠粪便中形成的主要SCFAs，其次是丙酸（15-37 μmol g^-1）、丁酸（9-24 μmol g^-1）、异丁酸（2-3 μmol g^-1）和戊酸（1.9-3.3 μmol g^-1），乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸分别占SCFAs总量的60-65%、15.6-21.7%、8.6-14.9%和1.7-2.3%，还检测到一定数量的戊酸（1.9-3.3 μmol g^-1）。与模型组和对照组相比，使用0.50 mg g^-1 BW day^-1 XOS干预的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸和戊酸的浓度分别为106.4、37.6、24.9、3.0和3.3 μmol g^-1。这些结果表明XOS的量对SCFAs的产生有影响。

（5）XOS对肠道微生物群的影响

 如图5A所示，使用番泻叶提取物的小鼠的肠道微生物结构出现了显著的改变。在对照组中，主要的门类是厚壁菌门（42.75%）、拟杆菌门（47.21%）、变形菌门（2.46%）、弯曲菌门（1.60%）和放线菌门（2.83%）。然而，在门水平上，番泻叶提取物处理后细菌有明显的变化，变形菌门和弯曲菌门的相对丰度增加到13.20%和3.97%，而厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和脱硫弧菌门的相对丰度分别下降到43.26%、37.67%、1.09%和0.228%。此外，与模型组相比，不同剂量的XOS干预处理在门水平上的细菌变化是不同的。在0.50 mg g^-1 BW day^-1的XOS干预处理下，厚壁菌门和放线菌门的相对丰度分别显著增加到59.90%和2.69%，而变形菌门的相对丰度下降到7.41%。在1.00 mg g^-1 BW day^-1 XOS的干预下，变形菌门的相对丰度显著下降到2.61%。

 如图5B-5D所示，模型组中用Chao1指数和Ace指数测定的平均丰富度较低，而Chao1指数和Ace指数随着XOS处理的进行而增加，尤其是1.00 mg g^-1 BW day^-1 XOS组，这些结果与Shannon指数的结果一致。α-多样性是通过主坐标分析（PCoA）的加权UniFrac距离来反映的。图5E显示，XOS干预治疗可以缓解番泻叶提取物引起的肠道微生物群的变化。

 如图6A-6C所示，在科水平上，在番泻叶提取物和0.25、0.50和1.00 mg g^-1 BW day^-1 XOS组中分别发现1、2、1和2个分类群。在属的分类水平上，在四个组中分别发现了1、3、1和3个分类群的优势群落。其中，在模型组中，拟杆菌科（Bacteroidaceae）和拟杆菌（Bacteroides）占优势。在X-L组中，Erysipelatoclostridiaceae、Desulfovibrionaceae和Ruminococcus_torques占优势。而Prevotellaceae、Anaerofustaceae、Alloprevotella和Ruminococcaceae是X-H组的主要微生物。图6D显示，与模型组相比，XOS干预小鼠显示出双歧杆菌和乳酸杆菌的丰度增加，拟杆菌的丰度显著下降。

试验结论

 XOS的饮食干预缓解了番泻叶提取物引起的小鼠腹泻，XOS可以降低DAI，防止组织损伤，抑制促炎因子，促进抗炎因子的产生，并维持肠道屏障。此外，XOS还通过增加普雷沃氏菌、瘤胃球菌和双歧杆菌的丰度来调节肠道微生物群的组成，且XOS可能对于干预腹泻具有多靶点作用。

参考资料：

Yanjun T ,Qinyue W ,Jieyu Z , et al.Orally Administered Xylo-Oligosaccharides (XOS) Ameliorates Diarrhea Symptoms in Mice via Intestinal Barrier Improvement and Gut Microbiota Modulation.[J].Molecular nutrition & food research,2022,66(20):e2200171-e2200171.