试验设计

 抗氧化活性测定：通过测量氧自由基吸收能力（ORAC）和羟基抗氧化能力（HORAC）来评估XOS的抗氧化活性。

‌ 采用人类细胞系：A549（来源于肺癌；ATCC® CCL-185TM）、HT-29（来源于结肠腺癌，ATCC® HTB-38TM）、MRC-5（正常肺成纤维细胞；ATCC® CCL-171TM）和U-937（来源于组织细胞性淋巴瘤，ATCC® CRL-1593.2TM）为研究对象，通过测定体外细胞毒性、抗肿瘤活性、细胞因子水平和谷胱甘肽水平等，评估XOS抗肿瘤活性。

试验结果

（1）XOS的抗氧化活性

 如表1所示，通过氧自由基吸收能力（ORAC）方法检测到了体外抗氧化活性，而通过羟基抗氧化能力（HORAC）方法检测到的抗氧化活性更低。

（2）XOS的细胞毒性和体外抗肿瘤活性

 如图1所示，与MRC-5成纤维细胞相比，XOS处理导致了肿瘤细胞系更强的细胞毒性作用；两种体外试验的数据显示，XOS可诱导时间和浓度依赖性的细胞抑制；与MTT试验结果相比，NR试验显示出更高的细胞抑制水平，这表明溶酶体特异性的细胞毒性机制；长时间使用XOS处理后HT-29和MRC-5细胞的线粒体和代谢活性降低。

 如表2所示，所有肿瘤细胞类型都显示SI高于2，证实了XOS样品的肿瘤特异性细胞毒性作用。

 如图2所示，XOS处理的癌细胞中线粒体膜电位降低（图2B）；JC-1染色显示，XOS对癌细胞的影响比对ATP浓度水平的影响更敏感。

（3）XOS减少U-937细胞促炎细胞因子的产生

 如图3所示，XOS处理并没有激活U-937的细胞因子产生，在LPS存在的情况下，XOS样品能够在类似于抑制剂EGCG的程度上减少炎症反应；与在仅有LPS的培养基中培养的细胞样品相比，两种类型的细胞因子水平都显著降低。结果表明，XOS可以影响Toll样受体4（TLR4）的信号通路，它介导了LPS激活的炎症反应。

（4）XOS-TLR4相互作用的分子模拟

 如图4所示，显示了最佳对接的复合物。

 如表3所示，木六糖和木五糖与TLR4的结合亲和力最高，计算结果分别为-8.3 kcal/mol和-8.1 kcal/mol；木四糖的结合亲和力（-7.7 kcal/mol）几乎与木七糖（-7.6 kcal/mol）一样；木二糖和木三糖与TLR4的对接研究显示分别只有-6.4 kcal/mol和-6.7 kcal/mol。

 如图5所示，木六糖和木五糖与TLR4（链A）和核心受体骨髓分化因子-2（MD-2）的七个氨基酸残基形成常规氢键（H-bonds）（图5D，E），木七糖和木四糖与六个氨基酸残基形成H-bonds（图5C，F），而木二糖和木三糖与四个氨基酸残基形成H-bonds（图5A，B），而木四糖与氨基酸残基ASP101以不利的键相互作用。

（5）XOS处理影响肿瘤细胞的谷胱甘肽平衡

 如图6所示，与在标准培养基中培养的对照组相比，XOS处理的肿瘤细胞所含的GSH水平降低，只有MRC-5细胞没有显示GSH浓度的差异。在XOS处理的MRC-5细胞中，氧化的谷胱甘肽形式被减少，而这种影响在XOS处理的肿瘤细胞中不明显。相反，A549细胞在XOS存在下培养后，GSSG增加，GSH/GSSG的比值说明了这些效应，甚至加强了这些效应。所有用XOS处理的肿瘤细胞类型都有GSH/GSSG比值的降低，但MRC-5成纤维细胞显示出相反的结果。

 如图7所示，显示了最佳对接复合物的三维结构。

 如图8所示，就传统的氢键而言，XOS与人类谷胱甘肽还原酶形成了强而稳定的结合，XOS在4（木二糖）和11（木六糖）之间形成常规氢键。木三糖、木四糖、木五糖、木六糖和木七糖与一个或两个氨基酸残基以不利的键相互作用；木六糖和木七糖与谷胱甘肽还原酶形成的常规氢键和碳氢键数量最多，表明与该蛋白有很强的相互作用能力。测试的低聚糖样品主要包含DP为6的XOS和DP更高的XOS（7），对接分析显示它们是谷胱甘肽还原酶的最佳结合物。

试验结论

 本文研究了市售玉米芯来源的XOS的抗氧化活性和抗肿瘤活性，抗氧化试验结果显示，XOS具有显著的抗氧化活性。体外细胞毒性试验显示，XOS对来自非肿瘤组织的MRC-5细胞影响较小，但三个测试的肿瘤细胞系显示出时间和浓度依赖性的抑制作用，XOS通过调节TLR4信号和细胞氧化还原状态来发挥其抗肿瘤作用，而细胞氧化还原状态又受到谷胱甘肽稳态的影响。以上结果表明，XOS的这些重要的生物学特性可以被用来开发更好的抗癌疗法和功能食品。

参考资料：

Batsalova T, Georgiev Y, Moten D, et al. Natural xylooligosaccharides exert antitumor activity via modulation of cellular antioxidant state and TLR4[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(18): 10430.