试验设计

动物实验：使用6月龄的雄性APP/PS1小鼠，体重为20-25克。研究前，小鼠在标准饲养条件下（12小时光照/12小时黑暗循环，22±2℃，自由进食和饮水）生活一周。小鼠被随机分配到五组：对照组（Con）、麻醉组、手术组（S）、XOS组和XOS+手术组（XOS+S）。麻醉组的小鼠接受了0.5小时的七氟醚麻醉。S组和XOS+S组的小鼠接受了部分肝切除术加0.5小时七氟醚麻醉；XOS和XOS+S组的动物在手术前五周和手术后一周用XOS灌胃（150微升/天，10%的XOS在PBS中，早上9点）；对照组、麻醉组和S组的小鼠用PBS灌胃喂食。在我们的初步实验中，六周的XOS干预对术后认知功能障碍和相关机制有保护作用。

麻醉和手术：麻醉组的小鼠在麻醉室接受新鲜空气/氧气中的2.5%（1.0 MAC）七氟醚麻醉，期间小鼠自主呼吸，并连续测量七氟醚浓度；最后，小鼠在充满100%氧气的室内在保温毯上恢复，直到它们醒来。S组和XOS+S组的小鼠在2.5%七氟烷麻醉下进行了部分肝脏切除术，通过一个2厘米的上腹部中线切口暴露肝脏，肝脏的左侧叶被切除，然后用5-0缝合切口，用碘伏消毒三次，然后用0.25%布比卡因浸润。手术后，小鼠在含有100%氧气的室内，在保温毯上进行恢复，每隔8小时在切口上涂抹一次盐酸利多卡因凝胶，直到术后2天。Con组的小鼠没有接受任何治疗。术后两天进行微生物群分析、行为测试、肝功能和葡萄糖水平的测量，四个组之间的肝功能和葡萄糖水平没有明显差异（表1）。

 Morris水迷宫试验：用Morris水迷宫试验评估空间记忆；水池被平均分成四个部分。小鼠面向水箱壁，从第一区到第四区依次放入水中，间隔时间为10分钟。在所有的试验中，小鼠被允许游泳，直到它们爬上隐藏的平台。如果小鼠在90秒内没有找到平台，它将被引导到平台上，并在那里停留30秒。小鼠在手术前5天和手术后7天内每天接受测试。在手术后的第3天和第7天，进行探针试验（在平台被移除后，允许小鼠游泳90秒），记录穿越平台区域的时间，并将其作为记忆功能的一个指标；水温保持在20-22℃，所有测试都在下午1点至4点之间完成。

 手术后两天，直接从小鼠肛门口收集新鲜的粪便颗粒，立即用液氮冷冻，储存在-80°C进行粪便样本DNA提取、PCR扩增、测序和生物信息学分析，并对测序数据进行处理；对小鼠海马体组织进行裂解，测量上清液中的蛋白质含量，进行西方印迹分析、ELISA检测，对收集的上清液进行IL-1β、IL6、TNF-α和IL-10分析；使用免疫荧光法确定内源性Iba-1蛋白在海马CA1区和齿状回（DG）的表达水平，对海马CA1区切片进行透射电子显微镜检查。

试验结果

（1）手术加麻醉，而不是单独麻醉，损害了APP/PS1小鼠的空间记忆

 如图1A所示，与Con组相比，S组的小鼠在术后第2天和第3天的逃逸潜伏期显著增加（P<0.05）；图1C和图1D显示，与Con组相比，S组小鼠在术后第3天的平台穿越次数明显减少（P<0.05）；图1A和图1C显示，单纯七氟醚麻醉对水迷宫试验结果没有明显影响（P>0.05）；图1B显示，在训练和探针测试中，三组之间的游泳速度没有显著差异（p>0.05），这排除了干预后运动和知觉能力对空间记忆的影响，这些结果表明，手术，而不是麻醉，损害了APP/PS1小鼠的空间记忆。

（2）XOS干预减轻了手术诱发的APP/PS1小鼠的空间记忆缺失

 如图2A所示，与Con组相比，S组的小鼠在术后第2天和第3天的逃逸潜伏期显著增加（P<0.05）；图2C显示，与Con组相比，S组小鼠在术后第3天的平台穿越次数显著减少（P<0.05）；图2A和图2C显示，XOS干预扭转了术后第3天平台穿越次数的减少以及术后第2天和第3天逃逸潜伏期的增加（P<0.05），然而，Con组和XOS组在逃逸潜伏期和平台穿越方面没有显著差异（P>0.05）；图2B显示，四个组在训练和逃逸潜伏期测试中的游泳速度是相当的（p>0.05），这些数据表明，XOS可以减弱手术引起的空间记忆障碍。

（3）XOS干预减轻了手术引起的肠道微生物群的改变

 如图3A和图3B所示，共筛选出46个分类群，线性判别分析的阈值得分为2。Con组中丰度较高的分类群主要属于变形菌门和放线菌门，Deltaproteobacteria和放线菌纲，双歧杆菌目，Desulfo-vibrionales和Coriobacteriales，属如Desulfovibrio，Dubosiella和双歧杆菌；S组中丰度较高的类群主要属于放线菌门、放线菌纲、红蝽菌目、疣微菌科和Eggerthellaceae科，属如放线菌属和疣微菌科_UCG_014；在XOS+S组中丰度较高的分类群主要属于Melainabacteria纲，Gastranaerophilales目，普雷沃氏菌科，Alloprevotella属，A2和疣微菌科_UCG_014；XOS组中丰度较高的分类群主要属于Muribaculaceae科和未分类的拟杆菌目，Faecalibaculum和Gordonibacter属。

 如图3C所示，主坐标分析（PCoA）显示，S组的肠道细菌组成与Con组有区别，XOS+S组与S组有区别，但XOS组与Con组没有明显区别；此外，我们发现有8个分类群在4个组之间有明显的变化；图4A-C显示，与Con组相比，S组有三个属（Rodentibacter、拟杆菌、Ruminococcaceae_UCG_ 014）明显增加（P<0.05），XOS干预减轻了S组中增加的菌属（p<0.05），但在对照条件下没有（p>0.05）；图4D显示，与对照组相比，S组的一个属（Faecalibaculum）明显减少（P<0.05），且XOS干预明显减弱了S组中该属的减少（p<0.05），但在对照条件下没有（p>0.05）；图4E和图4F显示，与S组相比，XOS+S组两种属(Muribaculum和Lactobacillus)显著增加(p<0.05)，但在S组和Con组之间或XOS组和Con组之间没有明显差异（p>0.05）；图4G显示，与Con组相比，S组有一个科（Eggerthellaceae）明显增加（P<0.05），XOS干预后显著降低了术后该科的增加（p<0.05）；图4H显示，S组与Con组相比，有一个科（Muribaculaceae）明显减少（P<0.05），且XOS干预后明显减弱了术后该科的减少（P<0.05）。

 总之，这些数据表明，手术改变了肠道微生物群的组成和丰度，而XOS可以调节手术引起的微生物群的变化，此外，肠道微生物群的改变可能与手术诱发的认知功能障碍有关。

（4）XOS干预减轻了手术引起的肠道炎症和屏障完整性损伤

 如图5A所示，与Con组相比，S组小鼠结肠中的促炎介质IL-1β、IL-6和免疫抑制介质IL-10明显增加（P<0.05），XOS干预改善了手术后IL-1β、IL-6和IL-10表达的增加（p<0.05），但在对照组中没有改善（p>0.05），然而，促炎介质TNF-α在4组中没有变化（p>0.05）。

 如图5B和图5C所示，与Con组相比，S组的紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达明显下降（p<0.05），而XOS干预增加了手术后ZO-1和Occludin的表达（p<0.05），但在对照条件下没有增加（p>0.05），然而，Claudin-5在四组中没有明显差异（p>0.05），这些结果表明，手术可能诱发肠道炎症反应和肠道屏障完整性的破坏，而XOS调节了肠道微生物群，缓解了手术引起的肠道屏障损伤和炎症反应。

（5）XOS干预减弱了手术诱发的BBB损伤 

 如图6所示，与Con组相比，S组的紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达显著下降（P<0.05），XOS干预增加了术后ZO-1和Occludin的表达（p<0.05），但在对照组中没有（p>0.05）；图6B和图6C显示，4组海马体中Claudin-5的表达差异无统计学意义（p>0.05）。

 如图6C所示，Con组小鼠基底层的超微结构是连续和完整的，紧密连接和内皮细胞是正常的；S组的小鼠在术后第2天出现BBB超微结构损伤，表现为局部基底层塌陷，紧密连接处开放；XOS干预改善了手术后的BBB损伤，包括基底层的塌陷和开放的紧密连接，此外，XOS组和Con组之间没有明显的超微结构差异。

（6）XOS干预减轻了手术诱发的神经炎症反应

 如图7A所示，与Con组相比，S组小鼠海马体中IL-1β、IL-6和IL-10的水平显著增加（P<0.05），XOS干预减轻了手术后IL-1β、IL6和IL-10水平的增加（p<0.05），但在对照条件下没有减轻（p>0.05），TNF-α的水平在四组中没有变化（p>0.05）。

 如图7B和图7C所示，与Con组相比，S组海马体CA1亚区和DG的Iba-1阳性细胞明显增加（P<0.05），XOS干预减轻了手术后Iba-1阳性细胞的增加（p<0.05），但在对照条件下没有此影响（p>0.05）；图7D显示，与Con组相比，S组的Iba-1表达明显增加（P<0.05），XOS干预减轻了术后Iba-1表达的增加（p<0.05），但在对照条件下没有减轻（p>0.05）。

 如图7E所示，与Con组相比，S组TREM2的表达显著下降（P<0.05），XOS干预增加了术后TREM2的表达（p<0.05），但在对照条件下却没有此影响（p>0.05）。

 这些结果表明，手术增加了IL-1β、IL-6和IL-10的表达，降低了TREM2的表达和促进了小胶质细胞的激活，而TREM2的表达变化可能是该过程中小胶质细胞激活的上游机制；此外，XOS干预可以减弱这些过程，这表明神经炎症反应依赖于肠道微生物群的改变。

试验结论

 在本研究中，研究了肠道微生物群在术后认知功能障碍的病理生理过程中的潜在作用，结果表明，手术刺激与麻醉，而不是单独麻醉，会诱发APP/PS1小鼠的空间记忆障碍；此外，手术改变了肠道微生物群，破坏了肠道屏障和BBB的完整性，并引发了外周和中枢炎症反应，而XOS干预可以稳定肠道微生物群，改善肠道屏障和BBB的完整性，并防止外围炎症介质渗入海马体，因此XOS干预可能是预防术后认知功能障碍的一种潜在方法。

参考资料：

Prebiotics Regulation of Intestinal Microbiota Attenuates Cognitive Dysfunction Induced by Surgery Stimulation in APP/PS1 Mice.[J].Aging and disease,2020,11(5):1029-1045.