试验设计

 细菌黏附能力的测定：

 ①XOS、细菌、细胞共孵育黏附试验：在12孔细胞培养板中接种IPEC-J2细胞，置于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至约90%时，更换培养基，加入PBS洗涤三次后的处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌菌液（1×10⁹ CFU/mL，MOI=100），同时在培养基中加入XOS至终浓度为20 mg/mL，对照组加入等体积PBS，37℃孵育1 h后PBS洗涤三次以去除未黏附的细菌，加入1 mL 1%Triton-100常温30 min裂解细胞，将细胞裂解液充分吹打混匀后进行倍比稀释，通过琼脂平板倒板法进行菌落计数，计算黏附细菌总数量。

 ②XOS预处理细菌、细胞黏附试验：黏附试验方法同上，鼠伤寒沙门氏菌与IPEC-J2细胞均用20 mg/mL XOS进行预处理，处理方法如下：细菌预处理：在细菌培养过程中加入终浓度为20 mg/mL的XOS溶液，对照组加入等体积PBS，置于37℃空气摇床培养至对数生长期，进行后续处理；细胞预处理：待12孔细胞培养板中的细胞生长至约80%时，弃培养基并用PBS洗涤细胞一次，加入新鲜培养基，并加入终浓度为20 mg/mL的XOS溶液，对照组加入等体积PBS，轻摇混匀后置于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至约90%时进行后续处理。

 qRT-PCR：培养鼠伤寒沙门氏菌并用20 mg/mL XOS对菌液进行处理，对照组加入等体积PBS，待细菌处于对数生长期，通过BIOG细菌RNA提取试剂盒提取鼠伤寒沙门氏菌总RNA并进行逆转录后，采用如表1所示体系进行qRT-PCR，以鼠伤寒沙门氏菌DNA消旋酶亚基基因gyrA（DNA gyrase subunit A）作为内参，对获得的信号、数据进行处理，根据公式2^-△△Ct计算目的基因相对于内参基因的比值以反映其表达丰度，引物信息见表2。

 pH测定：培养鼠伤寒沙门氏菌并添加20 mg/mL XOS溶液，置于37℃空气摇床220 r/min培养，每隔2 h测定一次细菌培养液的pH，测定前将菌液进行离心以分离菌体与培养液。

 Mg²⁺浓度测定：培养鼠伤寒沙门氏菌并添加20 mg/mL XOS溶液，置于37℃空气摇床220 r/min培养，每隔2 h测定一次培养液中的Mg²⁺浓度，离心后通过镁浓度检测试剂盒（微量法）测定Mg²⁺浓度。

试验结果

（1）XOS共孵育对鼠伤寒沙门氏菌黏附IPEC-J2细胞的影响

 由图1可知，与未加XOS组相比，XOS共孵育能够极显著（P<0.01）抑制鼠伤寒沙门氏菌对IPEC-J2细胞的黏附，在共孵育处理体系中，XOS、鼠伤寒沙门氏菌和IPEC-J2细胞三者同时存在，表明XOS能通过影响鼠伤寒沙门氏菌与IPEC-J2细胞之间的互作来抑制其对细胞的黏附作用。

（2）XOS预处理对鼠伤寒沙门氏菌黏附IPEC-J2细胞的影响

 由图2可知，与未加XOS组相比，XOS预处理的鼠伤寒沙门氏菌对IPEC-J2细胞的黏附能力显著降低（P<0.01）；XOS预处理IPEC-J2细胞组虽然未达到显著性（P>0.05），但是黏附细菌数量在数值上有一定的降低；另外设置共孵育处理组，结果与（1）相同，表明除了参与细菌与细胞间的互作外，XOS还能够通过影响鼠伤寒沙门氏菌本身从而抑制其对细胞的黏附能力。

（3）XOS对鼠伤寒沙门氏菌黏附素基因表达的影响

 由图3可知，通过基因筛选，我们发现XOS极显著（P<0.01）下调了鼠伤寒沙门氏菌黏附素STM0306基因的mRNA相对表达量（无显著性变化的基因结果未展示），表明XOS可能通过影响鼠伤寒沙门氏菌STM0306基因表达进而影响其的黏附能力。

（4）XOS对鼠伤寒沙门氏菌pH值的影响

 由图4可知，XOS处理组的pH在2 h和4 h均显著（P<0.05）低于未加XOS组。

（5）XOS对鼠伤寒沙门氏菌Mg²⁺浓度的影响

 由图5可知，XOS处理组培养基中的Mg²⁺浓度在2~6 h均低于对照组，且在4 h达到了显著性（P<0.05），表明XOS可能通过影响细菌培养环境的pH值和Mg²⁺浓度调控PhoP/PhoQ双组份系统的活性，进而影响下游STM0306基因的表达。

试验结论

 以IPEC-J2细胞为模型，探究了XOS对鼠伤寒沙门氏菌黏附能力的影响和黏附素STM0306基因表达的调控效果及机制，结果表明，XOS显著降低了鼠伤寒沙门氏菌对IPEC-J2细胞的黏附能力（P<0.05）；qRT-PCR结果表明，XOS处理导致鼠伤寒沙门氏菌黏附素基因STM0306表达量极显著降低（P<0.01）；进一步研究发现，XOS处理后鼠伤寒沙门氏菌培养基的pH值显著降低（P<0.05），Mg²⁺浓度显著提高（P<0.05）；结果显示，XOS可能通过调控菌液的Mg²⁺浓度在一定程度上抑制鼠伤寒沙门氏菌PhoP/PhoQ调控系统，进而抑制其下游基因STM0306表达，从而降低细菌对IPEC-J2细胞的黏附能力。

参考资料：

凌翀,于晓蕾,曹庆云等.低聚木糖下调鼠伤寒沙门氏菌STM0306基因表达并抑制其黏附能力的作用[J/OL].饲料工业:1-13.