试验设计

 选择24只6周龄的雄性Wistar大鼠，体重200-250克，所有的大鼠都被安置在一个温度为25±1°C的房间里，光照/黑暗周期为12小时，并接受特定的食物和水自由；首先，大鼠被随机分为两组，分别为正常饮食组（ND）和高脂饮食组（HF）（每组12只），ND组大鼠使用标准的颗粒饲料（19.77%的能量来自脂肪，能量含量为4.02千卡/克），HF组大鼠使用包括59.28%的能量来自脂肪，能量含量为5.35千卡/克的饮食来诱导肥胖；12周后，大鼠被细分为四组（n=6/组），具体如下：（i）正常饮食（ND）；（ii）用XOS处理的正常饮食（NDX）；（iii）高脂饮食（HF）和（iv）用XOS处理的高脂饮食（HFX）；XOS在磷酸盐缓冲液（PBS）中的浓度为1000 mg/mL，每天口服灌胃1 ml含XOS的PBS，持续12周，ND和HF大鼠接受无菌的PBS作为载体对照；在第24周结束时，收集大鼠的血液和尿液，所有大鼠都被吸入异氟烷麻醉，并被处死，处死后立即摘除肾脏，去囊并称重，一个肾脏被用来通过检测硫酸雌酮（ES）在肾皮质切片中的摄取量来确定转运体Oat3的功能，另一个肾脏用于通过Western blot分析确定蛋白质的表达，丙二醛（MDA），苏木精和伊红（H&E）染色进行形态分析和TUNEL检测，组织样本保存在-80℃，用于后续研究。

 血液和尿液的化学成分检测：禁食5-6小时后，用异氟烷对大鼠进行麻醉，从尾部侧静脉采集血样，测定血浆葡萄糖、总胆固醇的浓度、血浆胰岛素及血清肌酐水平；对于尿液分析，将动物放置在代谢笼中，以便能够24小时收集尿液，记录24小时内的摄水量和尿量，使用自动生化分析仪测量尿液肌酐和微量白蛋白，并通过肌酐清除率测量肾小球滤过率。

 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）：在第24周进行，将大鼠禁食12小时后，给大鼠灌胃葡萄糖溶液（2克/公斤体重），摄入葡萄糖15、30、60和120分钟后，对大鼠进行麻醉，收集血样以测量血浆葡萄糖水平，每个时间间隔的血浆葡萄糖以OGTT的曲线表示，并计算曲线下的总面积（AUC）。

 组织学检查：将大鼠肾脏沿横轴切成两半，固定在10%的中性缓冲福尔马林中，并嵌入石蜡，将石蜡包埋的标本切成2微米厚的切片，安装在显微镜载玻片上，用苏木精和伊红（H&E）染色，进行一般组织学评估，并在光学显微镜下检查样本，以观察是否存在肾小管和肾小球的变化。

肾脏Oat3功能的测定：肾脏Oat3功能用肾皮质切片摄取法进行评估；肾脏被摘除并放入新鲜的含氧、冰冷、改良的Cross和Taggart盐水缓冲液（包含：95 mM NaCl，80 mM甘露醇，5 mM KCl，0.74 mM CaCl₂和9.5 mM Na₂HPO₄，pH7.4），用Stadie-Riggs切片机切割肾皮质薄片（≤0.5毫米；5-25毫克，湿重）；将组织切片在含或不含胰岛素（30 µg/mL）的缓冲液中预培养30分钟，然后在室温下在含有50 nM [³H]硫酸雌酮（ES）（[³H]ES; Perkin Elmer）的1 mL缓冲液中培养30分钟；培养后，组织切片用0.1 M MgCl₂清洗，在滤纸上吸干，称重并溶解在0.4 mL的1 M NaOH中，然后用0.6 mL的1 M HCl中和组织中的NaOH，使用液体闪烁分析仪（Perkin Elmer）测量放射性，[³H]ES进入肾脏皮质组织的运输量被计算为对照组的百分比。

 肾脏皮质组织中的脂质过氧化（MDA水平）：为了测定肾脏的氧化应激，对肾脏皮质组织中的丙二醛（MDA）进行测定，根据制造商的协议，将肾皮质组织分离出来，在含有1%蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学）的CelLytic MT哺乳动物组织裂解/提取试剂（Sigma Aldrich）中悬浮并均质，然后在4℃下以1600 g离心10分钟，收集上清液并使用商业硫代巴比妥酸测定（TBAR测定）试剂盒（开曼化学公司）来测定肾皮质MDA。

 终端脱氧核苷酸转移的UTP缺口标记（TUNEL）测定：使用Calbiochem DNA碎片检测试剂盒（Millipore）检测石蜡包埋的肾脏组织切片中的凋亡细胞，通过终端脱氧核苷酸转移酶（TdT）与响应凋亡信号产生的DNA片段的暴露3′-OH末端结合，TdT催化了生物素标记的和未标记的脱氧核苷酸的加入，使用链霉蛋白-辣根过氧化物酶（HRP）结合物检测生物素化的核苷酸，二氨基联苯胺与标记的样品反应，在DNA断裂的部位（TUNEL阳性细胞）生成不溶性的棕色底物，在光学显微镜下检查和计算该底物。

 西方印迹分析：为了分析蛋白质的表达，将0.1克肾皮质组织样品在含有1%蛋白酶抑制剂混合物（罗氏应用科学）的裂解缓冲液（Sigma Chemical）中匀浆，并使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度；将蛋白样品与加载缓冲液混合，在95℃下加热10分钟，进行12%的SDS-PAGE，随后，转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore）；非特异性蛋白用5%的非脂干乳在Tris-缓冲盐水（TBS）或含有0.1% Tween-20的PBS在室温下阻断1小时，然后用CosmoBio有限公司的肾脏Oat3的特异性抗体（KAL-KE035）在4℃下培养过夜；蛋白质水平以β-肌动蛋白或GAPDH作为加载对照进行标准化；用缓冲液清洗三次，每次5分钟，然后用第二抗体孵育1小时，再用增强化学发光（ECL）试剂（Bio-Rad实验室）孵育5分钟；使用ChemiDoc Touch成像系统（Bio-Rad实验室）对蛋白带强度进行成像，并使用Image J（Adobe）进行分析。

试验结果

（1）补充XOS前后的代谢和肾脏参数

 由表1可知，与正常饮食喂养的大鼠相比，高脂饮食喂养的大鼠在食物和能量摄入、体重和总胆固醇水平方面都显著增加；在ND（对照组）和HF大鼠之间，空腹血糖水平没有显著差异；然而，与ND对照组大鼠相比，HF大鼠的血浆胰岛素水平显著增加（P<0.05），表明HF大鼠存在胰岛素抵抗情况，且摄水量、尿量、尿肌酐、血清肌酐和肌酐清除率在HF大鼠中没有变化；但与ND大鼠相比，HF大鼠的微量白蛋白尿有显著增加（P<0.05）；以上结果表明，在高脂饮食喂养12周后，HF大鼠的肾功能出现了损害。

 由表2可知，补充XOS 12周后的HF饮食大鼠即HFX大鼠，与HF大鼠相比，其食物和能量摄入、体重、总胆固醇和血浆胰岛素水平都有显著的下降（P＜0.05）；图1A结果显示，与ND大鼠相比，HF大鼠在摄入葡萄糖60和120分钟后，血浆葡萄糖水平显著升高（P<0.05）；图1B结果显示，HF大鼠在OGTT期间葡萄糖升高，反映其出现葡萄糖不耐受，这些结果与HF组的曲线下总面积（AUC）的增加相关；以上数据表明，HF大鼠在本研究中出现了胰岛素抵抗；用XOS处理HF大鼠后，与未处理的HF大鼠相比，这种情况显著改善（P<0.05）；与HF大鼠相比，HFX大鼠的尿液微量白蛋白水平显著下降（P<0.05）；与未经处理的HF大鼠相比，XOS的摄入也使HFX大鼠肌酐清除率显著增加（P<0.05），肾脏功能有所改善；此外，与ND大鼠相比，HF大鼠的肾脏重量与体重的比值显著下降（P<0.05）；与HF大鼠相比，在HFX大鼠中补充XOS不能增加肾脏重量与体重的比值。然而，在NDX大鼠中，补充XOS的代谢和肾功能参数与对照组相比没有显著的差异。

（2）XOS处理对肾功能和肾脏Oat3功能的影响

 如图2A所示，与对照组相比，HF饮食大鼠表现出肾功能受损，表现为微量白蛋白尿的显著增加和肌酐清除率的下降（P<0.05）；与HF相比，HFX的XOS处理可以改善这些损伤（P<0.05）；与ND对照组大鼠相比，HF大鼠肾皮质组织对[³H]ES的摄取显著减少，反映出大鼠肾脏Oat3功能的受损（P<0.05）；图2B和图2C显示，与ND大鼠相比，HF大鼠的肾脏Oat3功能下降与肾皮质组织的全细胞裂解液和膜部分的Oat3表达下降有关（P<0.05）；与HF大鼠相比，HFX大鼠的XOS处理使[³H]ES摄取量显著增加（P<0.05），这些结果与HFX大鼠全细胞和膜部分的Oat3表达量显著增加有关（P<0.05）。

（3）XOS处理对肾脏形态学和足细胞损伤的影响

 如图3A所示，高脂饮食大鼠的肾脏组织学，包括鲍曼囊和胞间隙的扩大、肾小球的萎缩和细胞脱落到肾小管腔内与肾功能的下降相关；图3B显示了这些变化被分级并报告为肾脏损伤的评分。

 如图3C和图3D所示，HF组的肾脏损伤评分显著高于对照组，用XOS处理后，HF大鼠表现出肾脏形态得以改善，损伤评分下降；此外，与ND组相比，HF组的足细胞nephrin和podocin的表达显著下降（nephrin和podocin：主要裂孔隔膜蛋白分子，维持足细胞结构和功能，其表达改变是足细胞损伤的重要标志）（P<0.05），以上结果表明，足细胞损伤与HF大鼠尿液中微量白蛋白的增加有关，且这些蛋白质在HF组表达水平的下降被XOS处理后恢复。

（4）XOS处理对肾脏氧化应激的影响

 如图4所示，与ND大鼠相比，HF大鼠肾皮质的MDA水平和4-HNE的表达显著增加（P<0.05）；与HF大鼠相比，HFX大鼠补充XOS后，MDA水平和4-HNE的表达显著下降（P<0.05）；如图5所示，与ND大鼠相比，HF大鼠的AT1R、NOX4和NOX2的组成部分p67^phox的表达显著增加（P<0.05），这些刺激在HFX大鼠中被XOS处理所抑制（P<0.05）；此外，与ND大鼠（P<0.05）相比，HF大鼠的PKCα磷酸化水平显著增加（P<0.05）；图6A结果显示，Nrf2 转录因子在全细胞裂解液中的表达在所有实验组中没有表现出显著差异；图6B结果显示，与ND大鼠相比，HF大鼠中细胞核中的Nrf2有显著增加（P<0.05）；图6C和图6D结果显示，在HF大鼠中也发现Keap1和Erk1/2有显著增加，表明Keap1与Nrf2的分离和Nrf2向细胞核的转移增加将促进抗氧化酶的产生；图6E和图6F结果显示，与ND大鼠相比，HF大鼠的抗氧化酶包括SOD2和GCLC的水平显著增加（P<0.05）；与HF大鼠相比，XOS处理HFX大鼠表现出削弱了SOD2和GCLC的表达（P<0.05）。

（5）XOS处理对肾脏细胞凋亡的影响

 如图7A所示，HF大鼠的组织呈现出TUNEL阳性细胞或DNA分裂的证据（如箭头所示的深棕色），而ND大鼠没有这样的证据；图7B结果显示，与ND大鼠相比，HF大鼠的TUNEL阳性细胞显著增多，而XOS处理导致了TUNEL阳性细胞的数量减少；图7C结果显示，与ND大鼠相比，HF大鼠中促凋亡蛋白Bax的表达显著增加（P<0.05）；然而图7D结果显示，当ND和HF大鼠比较时，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达没有显著变化，HFX大鼠的XOS处理尽管没有导致Bcl-2表达的增加，但导致Bax蛋白的表达减少（P<0.05）；图7E结果显示，Bax/Bcl-2的表达比值证实，与ND大鼠相比，HF大鼠的细胞凋亡显著增加（P<0.05）；与HF大鼠相比，用XOS处理可以降低Bax/Bcl-2的比率（P<0.05），表明XOS可以恢复HFX大鼠由肾脏细胞凋亡造成的损害。

试验结论

 总之，补充XOS能够改善HF大鼠出现的体重和胰岛素抵抗显著增加、足细胞损伤、微量白蛋白尿增加、肌酐清除率下降和Oat3功能受损现象，且XOS处理后，肾脏MDA水平和AT1R、NOX4、p67^phox、4-HNE、磷酸化PKCα和ERK1/2的表达都显著下降；此外，Nrf2-Keap1通路、SOD2和GCLC的表达以及肾脏的凋亡也被XOS显著抑制，表明XOS可以通过调节AT1R-PKCα-NOXs通路的激活，来减少氧化应激和细胞凋亡，间接恢复肥胖胰岛素抵抗大鼠的肾功能和Oat3功能，改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗模型中的肾脏功能紊乱。

参考资料：

Keerati W ,Sakawdaurn Y ,Wannipa T , et al.Prebiotic prevents impaired kidney and renal Oat3 functions in obese rats.[J].The Journal of endocrinology,2018,237(1):29-42.