试验设计

 试验对象：40只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠（平均体重21.2±0.2克），购自重庆医科大学动物实验中心。

 动物处理：将小鼠分为正常组、载体组、XOS-H组和XOS-L组，每组有10只小鼠，正常组喂食基础饮食（12.79%脂肪，66.67%碳水化合物，20.54%蛋白质），其余小组给予高脂饮食（60.65%脂肪，21.22%碳水化合物，18.14%蛋白质）以及给予XOS-L（250 mg/kg（b·w））和XOS-H（500 mg/kg（b·w））组，灌胃剂量为10 mL/kg，其他组给予相同数量的正常盐水，实验持续12周，每周对小鼠称重。灌胃干预后，收集血液、肝脏、附睾脂肪、小肠组织和盲肠内容物并储存在-80℃。

 附睾脂肪测定：附睾脂肪指数=附睾脂肪量（g）/小鼠体质量（g）×100。

 生物化学分析：用试剂盒分析血清中TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、谷丙转氨（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平。

 酶联免疫吸附试验：采用酶联免疫分析试剂盒分析血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-1β（IL-1β）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。

 组织学分析：分析肝脏和附睾脂肪的脂肪细胞直径，与正常组的相对脂肪细胞大小进行比较。

 实时定量聚合酶链反应：选择正常组、载体组、高剂量和低剂量低聚木糖组小鼠的肝脏和附睾脂肪作为脂质代谢相关关键基因的检测对象，实时逆转录酶定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析XOS在转录水平上对小鼠脂质代谢途径的影响。小肠组织被用来确定紧密连接（TJ）蛋白的相对表达，即闭合蛋白、Claudin-1和zonula occluden-1（ZO-1）。从肝脏、附睾脂肪和小肠组织中提取RNA，测定RNA浓度，然后将高质量的RNA反转录成cDNA，经荧光定量PCR，以β-肌动蛋白基因为参考基因，采用2-ΔΔCt相对定量法计算各组基因的表达量。

 蛋白质印迹分析：称量肝脏组织（100毫克），用试剂盒提取蛋白，对蛋白浓度进行量化，蛋白质变性后进行电泳，使用iBright FL1000成像系统进行图像显影，最后使用ImageJ软件对蛋白质表达进行量化。

 盲肠内容物中选定肠道菌群的相对丰度：采用粪便基因组DNA提取试剂盒从小鼠盲肠内容物中提取DNA进行RT-qPCR扩增，确定各组小鼠肠道中乳酸杆菌属、双歧杆菌属、罗斯氏菌属、厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度。

试验结果

（1）动物实验中的体重和附睾脂肪变化

 如图1A和1B所示，在12周期间，喂食基础饮食的正常小鼠的体重平均从21克增加到25克，体重增加率为19%；喂食高脂饮食的载体小鼠的体重从22克增加到32克，体重增加率为45%；与载体组相比，在XOS干预12周后，XOS-H组小鼠的体重显著减少16.32%。此外，如图1C和1D所示，载体组的附睾脂肪指数最大，脂肪堆积量也最大；在高、低剂量XOS干预12周后，小鼠的附睾脂肪分别减少了54.2%和48.3%，表明XOS可以减少高脂饮食引起的脂肪堆积。

（2）血脂和脂蛋白水平

 如表1所示，喂养12周后，与正常组相比，载体组的TG、TC和LDL-C含量分别显著增加了67.8%、47.4%和129.4%，表明高脂饮食成功地诱发了小鼠血脂异常；补充XOS可减轻血脂和脂蛋白水平，XOS-H组的TG、TC和LDL-C水平分别下降了45.7%、21.9%和41.0%。然而，在喂食高脂饮食的小鼠中，XOS并没有显著增加HDL-C的水平。

（3）血清AST和ALT活性

 如图2所示，ALT和AST作为体内重要的氨基酸转氨酶，是肝细胞损伤的标志物。与正常组小鼠相比，高脂饮食诱导的载体组小鼠血清中的ALT和AST活性显著增加（P＜0.05），说明高脂饮食对小鼠的肝脏造成了一定程度的损伤；XOS的干预有效地抑制了高脂饮食引起的ALT和AST活性的增加，缓解了肝脏损伤。

（4）血清细胞因子水平

 如图3所示，处理12周后，载体组小鼠血清中IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-1β的水平最高，IL-10的水平最低，而正常组小鼠则呈现相反的趋势；XOS降低了炎症刺激对小鼠的影响，包括血清炎症因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平下降，IL-10水平上升。然而，在不同剂量的XOS的干预下，没有发现显著差异。结果表明XOS增加了抗炎因子IL-10的水平，降低了血清中促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平，从而对高脂血症小鼠的血脂水平发挥了调节作用。

（5）组织病理学分析

 如图4A所示，正常组未见脂肪变性，组织结构清晰，同时肝细胞有丰富的细胞质，细胞膜清晰，排列规则，中心有大而正常的细胞核；如图4B所示，在载体组的肝细胞中可以看到不同形状的脂滴，细胞之间的界限也很模糊；在XOS干预后，小鼠肝细胞中脂肪泡的密度降低，脂滴更小、更分散、更稀少；如图4C和4D所示，细胞核位于细胞中心，其形态和结构基本正常，有逐渐恢复到正常肝细胞的趋势。同时，对肝组织中TG含量的测定也证实高脂饮食使肝脏中TG含量显著增加（P＜0.05）；如图4E所示，XOS的干预抑制了TG在肝脏中的积累，而高剂量XOS的效果更为明显，这表明XOS改善了肝脏脂质的积累。

 如图5A-5E所示，正常组的附睾脂肪中的脂肪细胞大小均匀，排列整齐，密度大；然而载体组的脂肪细胞是肥大的，排列松散，有些细胞甚至比正常组的脂肪细胞大一倍。对高脂血症小鼠灌胃不同剂量的XOS后，附睾脂肪细胞的外观得到改善，脂肪细胞变小，结构更紧密，特别是高剂量的XOS显著减少了脂肪细胞的肥大。如图5E所示，证实高脂饮食显著增加了（P<0.001）脂肪细胞的直径，而XOS明显改善了这一趋势（P<0.001），这与正常组的结果接近。

（6）小鼠附睾脂肪组织中RNA的表达情况

 如图6所示，初步探讨了XOS的调脂活性机制，通过RT-qPCR测定附睾脂肪组织中AMPK、ACC、CPT-1、C/EBPα、LPL和PPAR-α的基因表达。在正常小鼠样本中，AMPK、CPT-1和PPAR-α表达水平最高，而ACC、C/EBPα和LPL表达水平最低；载体组小鼠样本则完全显示出相反的趋势；灌胃250和500 mg/kg的XOS逆转了高脂饮食小鼠的基因表达，抑制了AMPK、CPT-1和PPAR-α的下调以及ACC、C/EBPα和LPL的上调；其中高剂量XOS的作用更强，小鼠附睾脂肪中相关基因的表达更接近于正常小鼠。

（7）小鼠肝脏组织中RNA的表达

 如图7所示，我们研究了肝脏组织中参与脂肪生成、脂肪酸氧化和胆固醇代谢的基因的mRNA表达。与正常组相比，载体组的AMPK mRNA表达明显减少（P<0.001）；在XOS灌胃干预后，AMPK表达增加，表明XOS干预激活了AMPK途径，增加了AMPK表达。激活AMPK调节脂肪酸代谢可能与AMPK同时参与机体分解和合成代谢的能力有关。高脂饮食增加了脂肪酸合成相关基因的表达，包括ACC、C/EBPα和PPAR-γ，但灌胃XOS则显著降低了它们的表达。同时，在XOS干预后，脂肪酸β-氧化相关基因（PPAR-α和CPT-1）在mRNA水平的表达增加。此外，高脂饮食降低了小鼠胆汁酸合成CYP7A1基因的表达。补充XOS增加了CYP7A1的表达，促进了胆固醇向胆汁酸的转化。

（8）小鼠小肠组织中RNA的表达

 如图8所示，高脂肪饮食对肠道黏膜有负面的调节作用，增加了破坏肠道屏障的细胞因子水平，并增加了破坏肠道屏障的菌群中的物种数量；因此通过RT-qPCR检测了实验小鼠肠道TJ蛋白occludin、claudin-1和ZO-1的表达。结果显示，与其他组相比，载体组的肠道中occludin、Claudin-1和ZO-1的表达量较低；不同剂量的XOS使occludin、Claudin-1和ZO-1的表达量增加。

（9）蛋白质在小鼠肝脏组织中的表达

 如图9所示，蛋白质印迹分析检测了小鼠肝脏中蛋白质的表达，高脂饮食降低了CYP7A1和PPAR-α的蛋白表达，增加了PPAR-γ和C/EBPα的蛋白表达；XOS-H干预显著抑制了PPAR-γ（p < 0.01）和C/EBPα（p < 0.001）表达的上调，以及PPAR-α表达的下调；XOS有增加CYP7A1表达的趋势，但影响不大。

（10）小鼠粪便中微生物RNA的表达

 如图10所示，以细菌总DNA为内参，各组小鼠盲肠中的厚壁菌门、乳杆菌属、双歧杆菌属、罗伊氏菌属、拟杆菌的相对表达，RT-qPCR结果显示高脂饮食增加了厚壁菌门、拟杆菌门的丰度，同时降低了乳酸菌属、双歧杆菌属和罗伊氏菌属的丰度，高脂饮食组厚壁菌门的丰度显著增加（P<0.01），是正常饮食组的5.55倍；拟杆菌、乳酸菌属、双歧杆菌属和罗伊氏菌属的丰度分别比正常饮食组下降0.43、0.01、0.17和0.61倍。在XOS干预后，特别是较高剂量的XOS，厚壁菌门的丰度下降了0.29倍，而拟杆菌、乳酸菌属和双歧杆菌属的丰度分别增加了1.81、63.33和8.06倍。然而，由于样本数量不足，这种差异可能不具有统计学意义。

试验结论

 本研究旨在研究XOS对喂食高脂饮食小鼠的影响，给小鼠分别喂食正常饮食或补充了XOS（250和500mg/kg）的高脂饮食，喂食12周，结果显示XOS抑制了小鼠体重增加，降低了附睾脂肪指数，并改善了血脂水平，包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。XOS降低了谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的活性，减轻了高脂饮食对肝脏的损伤；XOS还能降低高脂血症相关的炎症反应。此外，实时定量聚合酶链反应结果显示XOS干预激活了AMP活化蛋白激酶（AMPK）途径，以调节脂肪的合成、分解和β氧化；上调肉碱棕榈酰转移酶1（CPT-1）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）和胆固醇7-α羟化酶（CYP7A1）的mRNA表达水平；下调乙酰辅酶a羧化酶（ACC）、CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）、脂蛋白脂酶（LPL）mRNA表达水平。另一方面，XOS提高了小肠中zonula occludens-1（ZO-1）、occludin和claudin-1的mRNA表达水平，增加了肠道屏障的强度，并优化了肠道微生物群的组成，以上结果表明XOS具有改善高脂血症的治疗潜力。

参考资料：

Campbell J M , Jr F G , Wolf B W .Selected indigestible oligosaccharides affect large bowel mass, cecal and fecal short-chain fatty acids, pH and microflora in rats.[J].Journal of Nutrition, 1997, 127(1):130-136.