试验设计

 动物和试验设计：实验小鼠在22-24℃和40%-50%的相对湿度下饲养，12小时的光照/黑暗周期，自由获取水和食物。

 XOS对沙门氏菌引起的炎症的影响：将80只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠（21.6±1 g），随机分为四组：对照组（Con）、5%XOS处理组（XOS）、肠道血清型沙门氏菌S. Typhimurium-感染的小鼠组（Con-ST）和使用5%XOS处理肠道血清型沙门氏菌S. Typhimurium-感染的小鼠组（XOS-ST）；每组有5个重复笼子，每个笼子有4只小鼠；XOS组和XOS-ST组的小鼠给予含有5%的XOS（w/w）水； Con组和Con-ST组的小鼠给予不含XOS的水。14天后，Con-ST组和XOS-ST组的小鼠用200 μL PBS灌胃1×10⁶ CFU的沙门氏菌，而Con组和XOS组的小鼠只灌胃200 μL PBS；沙门氏菌感染后，每天记录小鼠体重变化；感染沙门氏菌和未感染沙门氏菌的小鼠在第5天被执行安乐死并收集样本。

 动物双歧杆菌乳亚种BB12对沙门氏菌引起的炎症的影响：45只雄性C57BL/6J小鼠（22.5±2 g）被随机分配到Con组、Con-ST组和动物双歧杆菌乳亚种BB-12（BB12）处理感染S.Typhimurium的组（BB12-ST），每组有4个重复笼子，每个笼子有3-4只小鼠。Con和Con-ST组小鼠每天口服200 μL PBS，BB12-ST组小鼠在200 μL PBS中含2×10⁸ CFU的BB12，处理持续14天。第15天，Con-ST和BB12-ST组用200 μL的PBS灌胃1×10⁶ CFU的沙门氏菌，而Con组的小鼠只灌胃200μL PBS，沙门氏菌感染后的第5天收集样本。

 BB12对沙门氏菌的体外抑制研究：将10⁷ CFU的BB12（0.1 mL）和10⁶ CFU沙门氏菌（50 μL）接种在同一培养基，在37℃下培养24 h，用PBS对培养基进行连续稀释，计算出平板上的CFU值，评估BB12对沙门氏菌的抑制作用；并检测BB12上清液对沙门氏菌的抑制作用、丙酸盐对沙门氏菌的体外抑制作用及BB12对沙门氏菌的抗粘附能力。

 定量检测小鼠组织样本和培养基中的沙门氏菌菌落总数，并对小鼠结肠样本显微镜下进行组织学分析、RNA的提取和定量、检测小鼠血清和结肠组织中IL-1β、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平、测定小鼠盲肠内容物和BB12上清液中的短链脂肪酸浓度（SCFAs）、小鼠结肠消化液的总基因组DNA检测和特定细菌的定量。

试验结果

（1）XOS对沙门氏菌感染的缓解作用

 如图1所示，根据图1A的试验设计，图1B结果显示5%的XOS补充剂明显缓解了小鼠感染沙门氏菌后的体重下降（p<0.05）；此外图1C-F显示，与Con组相比，Con-ST组小鼠表现出较短的结肠长度（p<0.05）和较高的组织学评分（p<0.05），这些症状通过XOS治疗后明显逆转（p<0.05）；图1G和图1H显示，与Con组相比，Con-ST小鼠的脏器指数和肝、脾沙门氏菌计数均升高（p<0.05），但在XOS-ST小鼠中有所缓解（p<0.05），这表明XOS减少了小鼠感染沙门氏菌后向周围器官的易位。

（2）XOS对沙门氏菌诱导的炎症的抑制作用

 如图2A所示，所有组别中结肠IL-1β、IL-6、TNF-α和CXCL-2 mRNA的表达没有差异（P>0.05），与Con-ST小鼠相比，XOS-ST小鼠降低了CXCL-1，增加了IFN-γ和IL10 mRNA表达水平（p<0.05）；图2B显示通过Elisa检测，Con-ST小鼠结肠中IL-1β、TNF-α和IL-10的蛋白含量高于Con小鼠（p<0.05），而与Con-ST组小鼠相比，XOS-ST组小鼠结肠中的IL-1β、TNF-α和IL-10的蛋白水平显著下降（p<0.05），且XOS组小鼠结肠中的IL-6、TNF-α和IL-10的蛋白水平比Con组低（p<0.05），这表明XOS减少了肠道炎症；图2C显示Con-ST小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的浓度显著高于Con小鼠（p<0.05），然而，与Con-ST小鼠相比，XOS-ST小鼠的这些蛋白水平显著下降（p<0.05）。以上数据表明XOS可以缓解沙门氏菌感染后的促炎症作用。

（3）XOS对肠道屏障的影响

 如图2D所示，粘液屏障蛋白，粘液蛋白-1和粘液蛋白-2以及结肠紧密连接蛋白-1（ZO-1）和闭合蛋白基因水平在所有组别中都没有影响（p>0.05），然而，XOS组小鼠的结肠紧密连接蛋白-1（CLDN1）表达量高于Con组。图2E结果显示，XOS处理也不影响血清D-乳酸水平（p>0.05）。

（4）XOS对肠道微生物群的调节和对动物双歧杆菌的促进作用

 如图3所示，分析了沙门氏菌感染后第5天结肠消化道样本中微生物群落的差异，图3A和图3B显示XOS和XOS-ST小鼠的Sobs和Shannon指数低于Con和Con-ST组，这表明补充含5%的XOS的水后，肠道微生物群的多样性明显下降；图3C基于Bray-Curtis距离的PCoA图表明，Con和Con-ST组的结肠微生物组成与其他组明显分离（R=0.6929，p=0.001），而XOS和XOS-ST组之间的微生物组成结构没有明显分离。

 如图3D和3E显示了门和属水平的细菌组成的相对丰度。在门水平上，所有组的结肠消化道中都以拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门为主。在XOS和XOS-ST组中，XOS处理与放线菌门的相对丰度增加有关。在属的层面上，Norank_f__Muribaculaceae属在四个组的结肠消化道中占优势，重要的是，与双歧杆菌相关的OUTs在XOS和XOS-ST小鼠中都被富集了。

 如图3F显示在门水平上，与其他组相比，Con-ST组小鼠的拟杆菌和变形菌门的相对丰度显著增加（p<0.05），而Con组小鼠的厚壁菌门比Con-ST和XOS-ST组高（p<0.05）；图3G显示在属的层面上，所有组的乳酸菌的相对丰度没有明显的变化（p>0.05），然而，沙门氏菌和大肠杆菌-志贺氏菌的相对丰度在Con-ST小鼠中表现出明显的属水平升高（p<0.05），但对其他组没有影响（p>0.05）；值得注意的是，图3F和图3G显示与非XOS处理组相比，XOS处理组中放线菌门和双歧杆菌属的相对丰度显著升高（p<0.05），而XOS和XOS-ST之间（p>0.05）或Con和Con-ST组之间没有发现差异。

 如图3H显示Con-ST组的细菌总复制数明显低于XOS组（p<0.05），但在Con、XOS和XOS-ST组内没有影响（p>0.05）；此外，大肠杆菌的复制在Con-ST组中急剧增加（p<0.05），XOS-ST组的乳酸菌复制数比Con和XOS组低（p<0.05），Con、XOS和Con-ST组内无差异（p>0.05）。图3I显示，摄入XOS显著地促进了结肠消化道中动物双歧杆菌的丰度。

（5）动物双歧杆菌乳亚种BB12减轻沙门氏菌的感染

 如图4所示，接种了BB12的小鼠在沙门氏菌灌胃后体重下降被抑制（p<0.05）,与Con组相比，Con-ST组小鼠的结肠长度更短，组织学评分、相对器官重量以及肝脏和脾脏中的沙门氏菌数量更高（p<0.05），但这些症状在BB12治疗的小鼠中也得到了逆转，说明BB12抑制了沙门氏菌的感染和易位（p<0.05）。

（6）动物双歧杆菌乳亚种BB12对沙门氏菌诱导的炎症和肠道屏障的影响

 如图5A所示，Con-ST组小鼠结肠中IL-1β、TNF-α和CXCL-2的相对mRNA表达高于Con和BB12-ST组（p<0.05），而Con和BB12-ST组之间没有差异（p>0.05）；三组之间结肠组织中IFN-γ、IL-6和IL-10的相对mRNA表达没有差异（p>0.05），然而，与Con组小鼠相比，Con-ST组的CXCL-1有增加的趋势（p<0.1）。同样，图5B显示，沙门氏菌感染后的小鼠结肠中IL-1 β、IL-6和TNF-α水平的显著增加也被BB12所缓解（p<0.05），而IL-10未能明显改变，此外，图5C显示与Con-ST小鼠相比，BB12-ST小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平有所下降（p<0.05）。

 如图5D显示，在Con-ST组和BB12-ST组之间没有发现结肠组织中紧密连接分子和粘液蛋白的相对表达差异（p>0.05）；然而，图5E显示BB12-ST组降低了血清中D-乳酸的浓度（p<0.05），这表明BB12可能改善上皮屏障。以上数据表明，BB12可以改善沙门氏菌诱发的炎症，并对结肠的机械和粘膜屏障产生轻微影响。

（7）动物双歧杆菌乳亚种BB12通过维持盲肠中的丙酸盐来抵抗沙门氏菌的定植

 如图6A和6B所示，在BB12灌胃14天后，动物双歧杆菌和BB12在粪便中的含量明显上升（P<0.05）；图6C和6D显示在沙门氏菌感染后的第5天，BB12-ST组盲肠内容物中的动物双歧杆菌和BB12水平明显高于Con组和Con-ST组；此外，图6E对盲肠内容物中总菌数、乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的复制数测定表明，与Con和Con-ST组相比，BB12-ST组小鼠的双歧杆菌数量显著增加（p<0.05），但BB12-ST组小鼠的沙门氏菌复制数显著低于Con-ST组（P<0.05）；在三组内，总细菌、乳酸杆菌和大肠杆菌的复制数没有改变（p>0.05）。

 如图6F-6J显示，所有组别都没有观察到对盲肠中乳酸、乙酸和丁酸水平的影响（p>0.05），但与Con-ST组小鼠相比，Con组和BB12-ST组的丙酸盐和总酸的浓度都有明显的增加（p<0.05）；图6K体外试验结果显示，当与盲肠内容物相同水平的LB培养基中丙酸浓度达到800 mg/L时，沙门氏菌的生长受到了极大的抑制(p<0.05)；以上结果表明，BB12通过维持肠道SCFAs的水平来减少沙门氏菌的数量。

（8）动物双歧杆菌乳亚种BB12对沙门氏菌体外生长和粘附的抑制作用

 如图7A所示，BB12和沙门氏菌的共同培养显示，沙门氏菌的生长受到BB12的极度抑制（p<0.05），图7B显示BB12的上清液也抑制了沙门氏菌的生长，且BB12的上清液比LB-MRS组有更明显的抑制作用，这表明BB12的代谢物可以影响其抑制作用。与体内不一致的是，乳酸和乙酸是上清液中的主要SCFAs，而在上清液中没有检测到丙酸盐，此外，图7C显示BB12显著降低了沙门氏菌在Caco-2细胞模型中的粘附能力（p<0.05）。

试验结论

 本研究探讨了益生元XOS对小鼠感染沙门氏菌后的保护作用及其机制，结果表明XOS可以通过调节肠道微生物群和减少病原体的数量来减轻沙门氏菌引起的炎症；XOS刺激动物双歧杆菌的丰度增加，动物双歧杆菌通过维持肠道SCFAs水平和抑制粘附能力来抵御沙门氏菌的定植，因此XOS可被视为一种功能性食品，通过刺激双歧杆菌从而通过维持肠道SCFAs水平和抑制粘附性来抵抗沙门氏菌的定植。

参考资料：

Pang J, Wang S, Wang Z, et al. Xylo‐oligosaccharide alleviates Salmonella induced inflammation by stimulating Bifidobacterium animalis and inhibiting Salmonella colonization[J]. The FASEB Journal, 2021, 35(11).