试验设计 原料：乳双歧杆菌MN-Gup；低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、菊粉纯度均为85%~90%，低聚甘露糖。 益生菌增殖活性的测定：将保存的乳双歧杆菌MN-Gup菌株在无菌条件下接种到MRS完全培养基，于37℃下培养活化24 h，然后再接种到MRS完全培养基中继续培养活化24 h，重复以上步骤活化3代，待菌种充分恢复活力后，取含有10 mL MRS培养基的试管接种MN-Gup活化菌液，接种后使样品中菌液浓度为1×108 cfu/mL，然后分别添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖和菊粉，设定添加1.5%葡萄糖和无碳源培养基为对照组，厌氧培养24 h，用益生指数（PI）来表示每种益生元的益生活性。 肠道微生态体外模拟模型的建立：配制结肠模拟发酵液，按质量比分别添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、低聚果糖、低聚甘露糖和葡萄糖，混匀后灭菌备用。 取3名成年人粪便称重，混合后按1:5质量比用生理盐水进行稀释，漩涡震荡，经500 g离心5 min去除大的沉淀物，得菌群悬液，按8:1:1体积比依次添加结肠发酵液、菌群悬液和MN-Gup菌体悬液，使每组MN-Gup终浓度为1×108 cfu/mL，然后以摇床37℃、转速90厌氧培养8 h，按DNA提取试剂盒操作步骤提取发酵液总DNA，并测定其DNA浓度。 肠道菌群增殖测定：按表1所示设计引物，取合成的拟杆菌属（Bacteroidetes）、厚壁菌属（Firmicutes）、双歧杆菌属（Bifidobacterium spp）、乳杆菌属（Lactobacillus spp）和阿克曼菌属（Akkermansia muciniphila）的标准质粒模板，按10倍比例稀释为8个点，按1 μL模板、上下游引物0.5 μL、8 μL水、10 μL SYBR酶配制成20 μL/孔的反应体系进行PCR扩增。以CQ值为纵坐标、模板DNA浓度的Lg值为横坐标，建立标准曲线。相同条件下，根据下列公式计算样品中目标菌群的比例。
试验结果 （1）不同益生元对乳双歧杆菌MN-Gup增殖活性的影响 由图1可知，低聚半乳糖具有更显著的促增殖活性，其PI值为2.18±0.19，其次为低聚木糖，其PI值为1.68±0.15，低聚果糖和低聚甘露糖促增殖活性最低。
（2）不同乳双歧杆菌合生元组合对肠道益生菌生长的影响 由图2可知，通过比较乳双歧杆菌MN-Gup搭配不同益生元组合对粪便菌群中益生菌的影响发现，低聚木糖组合促双歧作用显著高于其他益生元，其对双歧杆菌增殖的促进效果是低聚半乳糖的6倍。即在体外模拟肠道微生态体系下，低聚木糖更适宜作为MN-Gup的合生元来调节肠道双歧杆菌，而低聚半乳糖组则显著提高了乳杆菌比例。 本试验比较单一益生元对乳双歧杆菌MN-Gup的益生效果时发现低聚半乳糖促增殖最强，而在菌群中低聚木糖对双歧菌属的益生效果似乎更显著。这可能是因为菌群中其他种类的双歧杆菌对低聚木糖的利用率更高，具体原因需要进一步分析。这也从侧面反映出了多菌群体系下研究益生元的益生功能与单菌株发酵体系是可能存在差异的，相比较而言肠道微生态模拟体系可能更接近合生元在体内作用时的真实环境。
（3）不同乳双歧杆菌合生元组合对肠道厚壁/拟杆菌群比例、阿克曼菌（AKK）生长的影响 由图3可知，各合生元组对AKK菌群占比的影响不大，表明这5种低聚糖组合并不会显著影响AKK菌群的比例；与葡萄糖对照组相比，各合生元组均显著增加了厚壁/拟杆菌群的比值。
试验结论 本研究设计了基于体外肠道微生态模拟方法的益生元筛选方法，通过提取成年人粪便菌群后进行体外发酵，研究比较了不同合生元组合对肠道有益菌和重要菌群的调控作用，并与单菌株发酵体系的结果进行比较，结果发现低聚木糖与乳双歧杆菌MN-Gup组合后可显著提升菌群中双歧杆菌的比例，而单菌株发酵体系下低聚半乳糖更能促进MN-Gup的生长；各合生元组合对阿克曼菌的比例并无显著影响。
参考资料： 李树森,肖然,孙二娜,任怡镁,王辰元.基于体外模拟肠道微生态系统的乳双歧杆菌MN-Gup益生元筛选及其发酵特性研究[J].中国奶牛,2022(08):1-4. |
