试验设计

 试验设计：以C57BL/6为背景的野生型（WT）和Il10-/-小鼠（8周龄）作为研究对象，将雄性野生型（WT）小鼠被分配到WT组，Il10-/-小鼠被分别分配到白细胞介素-10基因缺陷（IL-KO）组和XOS组，每组有6-8只8周龄的小鼠，XOS组的小鼠接受1.0g/kg/天的95% XOS（由河南益常青生物科技有限公司提供）灌胃，持续4周后，将小鼠安乐死，收集其组织。

 结肠炎的评估：XOS干预期间，每周测量小鼠体重和疾病活动指数（DAI）的变化；收集结肠组织，用尺子测量；对用苏木精和伊红（H&E）染色的结肠标本进行组织学评分，每只小鼠0-4分，所有评分纳入相应组的统计。

 生化指标测定：测定结肠组织中的髓过氧化物酶活性、血清细胞因子IL-6、C-反应蛋白（CRP）和红细胞沉降率（ESR）；测量TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-17A的结肠信使RNA水平。

 评价粘液细菌的渗透：基于每个样品的整个肠道横截面的观察，使用荧光原位杂交法对DNA染色的切片进行盲评的，分数0-4；统计结肠隐窝中的细菌数量；测量结肠黏液的厚度。

 杯状细胞的数量以及膜腔面积的测定：计算杯状细胞的数量；测量小泡细胞的粘液填充面积。

 免疫印迹：将结肠组织均质化，在4℃下以15000转/分的速度离心15分钟，使用ImageJ软件进行量化，结果与GAPDH归一化，并以目标蛋白表达/GAPDH表达比率计算。

 肝脏和肾脏功能的测定：测定小鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、肌酐和尿素氮。

试验结果

（1）XOS干预改善了Il10-/-小鼠的自发性结肠炎

 如图1A-C所示，WT组和IL-10-KO组的小鼠体重差异从第2周开始升高，在第4周有显著差异；测量小鼠结肠组织发现IL-10-KO组小鼠结肠明显缩短，4周的XOS干预改善了生长缓慢和结肠缩短的情况；图1D显示，在DAI方面，Il10-/-小鼠的得分随着时间的推移逐渐增加，且与WT小鼠相比更高，表明有明显的结肠炎；图1E显示，组织学上，Il10-/-小鼠出现了明显的肠道炎症，粘膜上有零星的免疫细胞堆积，肠腺结构受损；图1F显示，Il10-/-小鼠的炎症评分明显高于WT小鼠，XOS组的Il10-/-小鼠有明显的轻度结肠炎症，炎症评分较低，并伴有少量的炎症细胞浸润和腺体结构损伤。

（2）XOS干预改善了中性粒细胞浸润和细胞因子表达

 如图2A所示，与WT小鼠相比，Il10-/-小鼠的MPO浓度更高，XOS干预后MPO浓度显著降低；图2B-E显示，与IL-10-KO组相比，XOS组小鼠的TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-17A的表达水平更低；图2F-H显示， Il10-/小鼠血液中的IL-6、ESR和CRP水平在第8周至第12周显著增加，而在XOS干预组中增加不明显。

（3）XOS干预改善了Il10-/-小鼠的粘液细菌渗透情况

 如图3A所示，在WT小鼠中，细菌处于在内层粘液层之外，微生物群在内层粘液层和腔内粪便内容物之间形成一个线性结构夹层；Il10-/-小鼠的细菌与上皮细胞直接接触，其中一些细菌位于隐窝深处，这表明细菌的渗透发生在肠结肠炎发生的早期，在XOS的干预下，细菌的渗透得到了明显的改善；图3B-D的结果显示，与WT小鼠相比，Il10-/-小鼠的隐窝表面和底部有更多的细菌定植，而XOS干预可以减少细菌的定植。

（4）XOS干预调节了Il10-/-小鼠的粘液屏障

 如图4A和图4B所示，三组中所有小鼠的粘液层和杯状细胞的厚度相似；图4C结果显示，在Il10-/-小鼠中，粘液填充的杯状细胞膜面积减少；图4D对WT小鼠组织的评估显示，上皮细胞表面有明显的粉红色染色（中性碳水化合物）（可能是分泌的粘液蛋白），而杯状细胞内有明显的蓝色染色（酸性碳水化合物），相反，Il10-/-小鼠的组织显示出粘蛋白染色的显著变化，整个组织呈深蓝色/紫色，表明中性和酸性粘蛋白的分布和表达模式发生了变化。以上说明XOS的作用不仅影响了杯状细胞的数量，而且还显著改善了粘液填充的杯状细胞膜面积，且在XOS干预后，WT型小鼠Il10 - / -小鼠的PAS/AB染色变化得到改善。

（5）XOS干预恢复了Il10-/-小鼠的自噬功能

 如图5所示，免疫印迹结果显示，在Il10-/-小鼠中，LC3-II蛋白和LC3-II/I的表达都明显减少，p62和beclin-1的表达增加。经XOS处理后的Il10-/-小鼠恢复了上述变化，说明XOS干预恢复了Il10-/-小鼠的自噬功能。

（6）XOS干预的安全性

 如图6所示，小鼠每天口服灌胃1.0g/kg 95% XOS耐受性良好，没有观察到明显的宏观不良反应，每组的肝肾功能在基础和干预后都没有明显的变化。

试验结论

 本文通过研究XOS干预对Il10-/-小鼠（IBD模型）的影响，结果表明XOS干预的Il10-/-小鼠呈现出明显的轻度自发性结肠炎，疾病活动指数、组织学评分和肠道炎症细胞因子水平较低；饮食中的XOS降低了在肠道结肠炎发病早期的肠道粘液的细菌渗透率；XOS的作用与结肠中LC3II/I的表达回复和p62及beclin-1的表达减少有关。因此XOS降低了结肠粘液微生物群的渗透，并恢复了自噬的功能，表明XOS可能是一种潜在的膳食补充剂或功能食品，可用于IBD的早期管理。

参考资料：

Chen Z, Shen X, Zhou Q; et al. Dietary xylo-oligosaccharide ameliorates colonic mucus microbiota penetration with restored autophagy in interleukin-10 gene-deficient mice.[J].JPEN. Journal of parenteral and enteral nutrition,2021,Vol.46(5): 1130-1140.