试验设计 原料：乳清浓缩蛋白WPC 80，蛋白质含量≥80%；低聚木糖，低聚木糖含量95%。 实验方法：分别称取不同质量的低聚木糖与乳清蛋白混合，用去离子水将其溶解，使得乳清蛋白质量浓度为120 g/ L，低聚木糖的最终质量浓度分别为10、30、60、90、120 g/L，室温下磁力搅拌2 h，得到混合溶液；再用2.5 mol/L的NaHCO3将溶液pH调节为8.0，保鲜膜封口，于85℃恒温水浴锅中加热2.5 h，期间分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h时取样，用冷水迅速降至室温，冻干得糖基化乳清蛋白（GWP）粉末。 以接枝度确定糖基化时间制得糖基化乳清蛋白，通过红外光谱图分析其二级结构变化，再探究低聚木糖添加量对糖基化乳清蛋白的凝胶色差、持水性、质构特性、微观结构及流变性质的影响。 试验结果 （1）接枝度分析 由图1可知，随反应时间的延长，不同低聚木糖添加量下的GWP接枝度持续增加，其中低聚木糖添加量为1%的GWP接枝度在2 h时达到最高，随着反应时间进一步延长，接枝度降低；当反应进行到2 h时，GWP接枝度随低聚木糖添加量的增加而升高，添加6%低聚木糖时，GWP接枝度达到（14.73±0.67）%，高于其他样品组，但当低聚木糖继续添加时，接枝度开始降低，此外，GWP的接枝度在2 h之后随时间的延长增加幅度减小，说明时间对其影响程度减弱，为避免持续加热可能会对糖基化蛋白的风味及色泽造成不良影响，所以后续糖基化乳清蛋白的制备时间选择湿热处理2 h。
（2）FTIR分析 由图2可知，在3700~3200 cm-1处，相较于WPC而言，GWP的频带变宽且光谱的谱带强度出现变化，这是由于低聚木糖糖链上含有大量-OH，在糖基化反应发生后，肽链接入糖链，羟基数量增加，而-OH在3500 cm-1左右处具有伸缩震动，且大约在3300 cm-1处有-NH 的弯曲震动，-OH的伸缩震动及-NH的弯曲震动引起了光谱图的改变，由此说明蛋白质上的氨基参与了反应，形成酰胺；此外，羟基在1200~1000 cm-1处具有特征吸收峰，而GWP在1020 cm-1左右处较WPC有更强的吸收峰，进一步说明糖基化反应引入了大量-OH，此外，-CH在 3000 cm-1左右处反不对称的拉伸振动则说明了糖链的共价接入；通过对乳清蛋白糖基化前后的红外光谱分析可知，糖基化反应引入了大量羟基，改变了蛋白质分子的二级结构。
（3）凝胶色差分析 由表1可知，GWP凝胶的L*亮度值受低聚木糖添加量的影响显著（P<0.05），在所研究的浓度区间内，各GWP凝胶与黄油的L*亮度值均在85.00至90.00之间；各GWP样品之间的a*红度值差异不显著（P>0.05）；GWP凝胶的b*黄度值较WPC凝胶显著增加（P<0.05），此外，b*黄度值是影响GWP表观色泽的主要参数，各GWP凝胶的b*黄度值处于WPC与黄油之间，表明在本试验条件下制备出的GWP凝胶在色泽上相较于WPC更适合作为脂肪替代品来代替黄油、动植物油，也可作为增稠剂添加在部分色泽相近的食品中如蛋黄酱、肉品肠等，且可改善此类食品的感官品质。
由图3可知，乳清蛋白经低聚木糖改性后其凝胶持水性显著提高（P<0.05），且随着低聚木糖添加量的增加持续升高，当低聚木糖添加6%时，GWP的凝胶持水性达到最高（82.15±0.41）%，较未改性乳清蛋白凝胶（62.15±1.10）%提高了（36.51±4.39）%，而当继续添加低聚木糖时，GWP凝胶持水性开始下降。
（5）质构特性分析 由表2可知，当添加6%的低聚木糖时，GWP的凝胶硬度、弹性、内聚性及咀嚼性均达到最大值，其中，不同添加量的低聚木糖对GWP的凝胶硬度影响显著（P<0.05)，当低聚木糖添加6%时，GWP的凝胶硬度显著大于其他样品组（P<0.05)；弹性反映的是凝胶在外部应力下发生形变后，恢复原状的能力，GWP的凝胶弹性于6%时达到最大值，表明低聚木糖此添加量下，GWP形成的凝胶网状结构紧密性达到最大程度，此时凝胶具有较好的弹性固体特征；咀嚼性是一个能客观反映出食品口感的关键指标，低聚木糖添加量为6%时咀嚼性显著大于其他样品组（P<0.05），表明此时GWP 凝胶口感最佳；各凝胶样品的内聚性无显著区别（P>0.05），且当低聚木糖添加量继续增加时，凝胶的硬度、弹性等指标均下降。
由图4可知，WPC所成凝胶呈海绵网状结构，是典型的堆积型凝胶，而GWP凝胶结构中细凝胶束增加，这与预凝胶时体系中固形物总浓度以及蛋白质分子的变性与聚集的相对速率有关，且GWP凝胶孔径比WPC凝胶大，不同低聚木糖添加量下的GWP的凝胶结构区别明显，其中，接枝度相对较高的GWP(6% XOS)的凝胶网络结构中孔洞分布规则、均匀，且孔径大小适中，有利于截留更多的水分子，使凝胶持水性提升，而当低聚木糖继续添加时，凝胶中的孔径较大，凝胶致密程度开始下降，使得水分子易流失，由此可知，低聚木糖的引入能够显著改变乳清蛋白的网络结构，进而影响了乳清蛋白的凝胶特性。
由图5（a）（b）可知，在25～90℃升温阶段，初始阶段，各体系的储能模量（G′）及损耗模量（G″）均很小，且G″>G′，说明此时体系流动性较大，以粘性为主，当温度继续升高时，蛋白质分子因热运动加快而开始交联，各体系的G′与G″相继骤增，且G′增加幅度远大于G″，表明体系发生相转变，开始出现凝胶网络结构，弹性固体特征逐渐明显；90℃恒温阶段，各体系G′、G″继续平稳增加，此阶段二硫键促进蛋白分子进一步交联；而90℃到25℃的降温期间，G′、G″进一步增大，此阶段主要是变性蛋白分子间的氢键发挥作用；最终，WPC的G′及G″分别达到297.03 Pa、53.21 Pa，GWP的G′及G″分别为：463.75 Pa、82.81 Pa（1%XOS）；676.70 Pa、121.99 Pa（3%XOS）；1287.65 Pa、228.21 Pa（6%XOS）、1059.74 Pa、176.86 Pa（9%XOS）；760.17 Pa、166.82 Pa（12%XOS），可见GWP的G′及G″较WPC明显增加，这表明低聚木糖的加入显著提高了乳清蛋白的粘弹性，且当添加6%的低聚木糖时，GWP的G′及G″值最大，说明此时体系的粘弹性最高，其G′较未糖基化乳清蛋白提高了3.34倍，因此在低聚木糖添加量达到6%时，蛋白质的糖基化修饰效果最佳，形成的凝胶结构最稳定，此时GWP具有最高的储能模量；随着低聚木糖添加量继续增加，凝胶的空间网络结构被削弱，导致凝胶G′降低，以上研究结果也验证了质构特性的准确性。 由图5（c）可知，温度扫描开始时，各体系的tanδ值（损耗模量（G″）与储能模量（G′）的比值）均大于1，在同一扫描温度下，GWP的tanδ值随着低聚木糖添加量的增加有增大趋势；随着扫描温度继续升高，tanδ值均逐渐降低至小于1。WPC凝胶温度为77. 05℃，GWP的凝胶温度分别为：59.37℃（1%XOS）、63.40℃（3%XOS）、78.07（6%XOS）、84.65℃（9%XOS）、84.13℃（12%XOS），由此可知，随着低聚木糖添加量的增加，各GWP体系凝胶温度逐渐升高，在低聚木糖添加量为6%时，GWP的凝胶温度与WPC相近，均为78℃左右。
本研究通过分析不同添加量的低聚木糖与乳清蛋白在糖基化反应过程中，GWP接枝度变化趋势，确定糖基化反应时间为2 h的GWP作为研究对象，此时经6%低聚木糖修饰得到的GWP接枝度最大，通过分析各样品红外光谱图的变化，则证明了低聚木糖糖链被共价引入蛋白体系，GWP制备成功，再进一步分析不同低聚木糖添加量下的GWP的凝胶特性后,发现各GWP凝胶均具有良好的色泽,且持水性、质构特性、粘弹性均得到改善。当低聚木糖添加量为6%时，GWP凝胶具有最好的持水性、最高的粘弹性，且凝胶的弹性、内聚性、咀嚼性等衡量食品感官品质的重要指标都达到最佳。低聚木糖添加量大于6%后，GWP凝胶持水性、动态黏弹性逐渐变差，其质构特性各项指标也开始下降。因此，在糖基化时间为2h时，经6%低聚木糖修饰的GWP的凝胶特性最好，可作为脂肪替代品或增稠剂应用于烘培类及其他与之色泽相近的食品中，例如饼干、蛋黄酱、鸡肉香肠等，为进一步改善乳清蛋白的凝胶特性、开发乳清蛋白及低聚木糖在食品加工中的应用潜力提供了理论依据与数据支撑。
参考资料： 李倩文,张莉杰,张川,李阳,陈树兴.低聚木糖对糖基化乳清蛋白凝胶特性的影响[J/OL].中国乳品工业:1-10. |
