试验设计

选择24只雄性无特定病原体的（SPF）C57BL/6NTac（B6）小鼠（Taconic）作为研究对象，小鼠被分为2组，饲养在我们的动物设施中，每个笼子6只小鼠。实验组从3周龄开始，以多糖为基质，自由饮食补充有10% XOS的Altromin C1000鼠粮，对照组则是自由饮食不添加任何补充物的Altromin C1000鼠粮；在喂食XOS饮食10周后，对所有小鼠进行称重；在11周龄时，从每只小鼠中采集20 mL全血，从脸颊上的颈静脉交界处提取RNA；所有小鼠在13周龄时都被麻醉，然后用颈椎脱位法处死；小鼠被处死后，收集粪便和盲肠内容物并储存在-80°C，直到提取DNA，并通过qPCR进行细菌图谱分析，和基因表达分析。

试验结果

（1）膳食XOS增加了整个小鼠肠道的双歧杆菌属

如表1所示，未发现XOS饮食对任何消化道节段的拟杆菌门有显著的影响，喂食XOS小鼠的盲肠内容物中厚壁菌门的细菌数量比对照组喂养的小鼠高1.3倍（P<0.01）；乳酸菌，属于厚壁菌门中的一个属，在喂食XOS小鼠的盲肠中含量明显比对照组高5.2倍（P< 0.05）。此外，在所有测试的肠道切片中，喂食XOS小鼠的双歧杆菌数量都有显著增加（P<0.01），且盲肠内容物中的双歧杆菌含量高出对照组47倍。

如图1所示，在喂食XOS后，回肠中双歧杆菌的比例最高；在对照组中，双歧杆菌和乳酸菌都占十二指肠总微生物群的3%；在回肠中分别占8%和15%；在大肠中，这些菌属的比例不超过0.5%。以上实验数据表明XOS不仅在结肠和盲肠中发酵，而且在小肠中也对微生物群产生了影响。

为了消除体重这一可能的混杂因素，在小鼠10周龄时对其进行称重，没有观察到体重的差异；XOS组的体重为25.3±0.3克，对照组的体重为24.5±0.4克。 

（2）膳食XOS诱导了抗菌蛋白RegIIIγ的局部表达

如图2A所示，与对照组小鼠相比，喂食XOS的小鼠十二指肠和回肠IECs中的RegIIIγ都显著被上调了（P<0.01）（图2A）。如图2B所示，编码GPR43受体的Ffar2的基因表达也在小肠和大肠的肠细胞中进行了分析。在mRNA水平上，XOS组和对照组之间没有发现差异，表明该受体的从头合成不受XOS饮食的影响。如图2C所示，为了研究IECs的局部先天免疫反应，分析了Tnf、Il18、Cxcl1和Cxcl2在小肠和大肠的肠细胞中的表达；编码角化细胞源性趋化因子（KC）的Cxcl1的表达，是小鼠吸引中性粒细胞的重要趋化因子，与未处理组相比，XOS组中从十二指肠分离的IECs显著增加（P<0.05），而两组间回肠的表达无差异。与对照组相比，XOS喂养小鼠的所有肠细胞中促炎细胞因子TNF-α和IL-18以及趋化因子CXCL2（巨噬细胞炎症蛋白2）的mRNA水平都不受影响。

如图3所示，XOS组回肠上皮细胞中Slc9a3的表达往往大于对照组（P=0.06），这仅仅表明喂食XOS小鼠的小肠对SCFAs的吸收增加。

（3）在喂食XOS的小鼠中，免疫相关基因的系统性表达发生了变化

如图4A所示，为了证明XOS可能具有的系统性抗炎作用，我们在10周龄时测量了全血中Il1β的表达，发现XOS组的表达量显著低于对照组（P<0.01）。一些细胞因子，包括1型和2型IFN，刺激中性粒细胞诱导促炎细胞因子的表达，IL-18刺激NK细胞和T细胞产生了IFN-γ；如图4B所示，为了评估这种刺激是否也受到XOS干预的影响，测定了Ifnγ的表达，结果发现XOS组小鼠的全血中Ifnγ的表达显著少于对照小鼠（P<0.05）；如图4C和4D所示，全血中IL-18和Ffar2的表达量在XOS组比对照组更大，但组间差异不明显（分别为P=0.05和P=0.09）。

如图5A所示，发现Il1β和Ffar2的表达被5-10 mmol/L的丙酸以剂量依赖的方式下调，而用乙酸处理与未处理的样品没有明显的差异（P=0.28）。如图5B和5D所示，与处理过的样品相比，在血液中加入丙酸后，Ifnγ和Il18的表达被下调；然而仅在加入10 mmol/L丙酸后，Il18的表达才与未处理的样品有显著差异（P<0.01）。

（4）补充XOS的饮食减少了促炎细胞因子的局部产生

为了研究XOS饮食的局部和全身适应性免疫反应，特别是IFN-γ，在XOS处理后在血液中的表达减少，从脾脏和MLN中分离出细胞，用流式细胞仪进行分析。与对照组小鼠（所有CD4+T细胞为1.8±0.2%）相比，XOS喂养的小鼠MLN中产生IFNγ的T细胞比例较低（P<0.01），这表明对这种促炎细胞因子有局部下调作用；研究了双歧因子XOS处理对产生IL-10的Treg细胞的抗炎作用，然而在MLNs或脾脏的抗炎细胞因子IL-10的产生方面，两组之间没有发现显著的差异；对于FoxP3+ Treg细胞和已知可诱导Treg细胞的耐受性CD103+ DCs的水平也得到了类似的结果，这表明双歧杆菌比例的增加没有直接接触和影响这些调节性免疫细胞区间。

试验结论

本研究表明双歧因子XOS不仅在结肠而且在整个小肠中也增加了双歧杆菌的数量；防御素再生胰岛衍生蛋白3γ（RegIIIγ）的上调可能是作为一种保护，防止细菌与粘膜屏障之间相互作用的增加。因此，XOS分解发酵产生的SCFAs可能是血液中观察到的IL-1β和其他促炎细胞因子表达减少的间接原因。

参考资料：

Hansen C H F , Hanne Frøkiær,  Christensen A G , et al. Dietary Xylooligosaccharide Downregulates IFN-γ and the Low-Grade Inflammatory Cytokine IL-1β Systemically in Mice[J]. Journal of Nutrition, 2013, 143(4):533-540.