试验设计 分别称取适量低聚木糖与乳清分离蛋白（WPI）分散在去离子水中制备固形物浓度为10%（W/V）的溶液，改变低聚木糖与WPI质量比分别为1:1、1:2、1:3、1:4，在4℃冰箱中充分水合12 h得到溶液。反应前用0.1 mol/LNaOH调节溶液的pH为8.0，90℃水浴加热，不同时间分别取样后迅速冰浴终止反应，所得溶液经冷冻干燥留待后用。取反应过程中 0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min样品通过冰浴终止反应后测定体系的 pH 值变化；在294 nm处测定WPI和低聚木糖的美拉德反应产物（MRPs）的吸光度，作为非酶促褐变中间产物形成的指标；在420 nm处测定MRPs的吸光度，作为在更高级阶段形成棕色聚合物的指标；采用比浊法计算MRPs乳化活性指数（EAI）和乳液稳定性指数（ESI）；采用DHR-2流变仪对MRPs的动态和静态流变学性质进行测定。 试验结果 （1）反应中溶液pH变化 如图1所示，随着反应时间的延长，4个体系的pH均呈现下降趋势。在反应最初的 0.5 h内体系pH迅速下降，此后pH缓慢下降直至反应结束，并且pH从8.01降至7.77~7.51，其中低聚木糖与WPI比例为1:4时，pH变化最小，比例为1:1时变化最大。
（2）UV-Vis吸光度的变化 如图2a、2b所示，分别为不同比例的反应体系（低聚木糖：WPI）初始时刻和反应2.5 h时在294 nm和420 nm处的吸光度，四种体系反应后在两种吸光波长处的吸光度都有所增加。从294 nm处吸光度的增加来看，比例为1:2的反应体系增量最大（0.075±0.025）；而比例为1:1的反应体系增量最小（0.030±0.0073），这说明比例为1:2 的体系在反应中产生的酮类和醛类等高活性中间产物最多，而比例为1:1的体系产生的中间产物最少；从420 nm处吸光度的增加来看，比例为1:2的反应体系增量最大（0.076±0.0082），说明该比例下反应产生的类黑素最多，而另外三个比例吸光度的增量无显著性差异，这与294 nm处结果相对应。类黑素是由上述产物经过环化、异构化、缩合等反应形成的棕色含氮聚合体，因此类黑素的含量与中间产物的积累量有关，这与本文研究结果一致。
（3）低聚木糖-WPI美拉德产物粒径分析 如图3所示，WPI经过湿热法美拉德反应前，各体系的平均粒径范围均在200~450 nm；反应2.5 h后，分子量增大，而平均粒径减小，各体系的平均粒径范围均在80~250 nm，其中比例为1:3的平均粒径最小为94.88±1.88 nm，比例为1:2的平均粒径最大为 214.83±4.80 nm。
（4）低聚木糖-WPI美拉德反应产物的乳化性能 如图 4a、4b所示，分别为不同比例的低聚木糖-WPI体系美拉德反应前后乳化特性的变化，其中湿热处理前后的WPI 作为对照组。 由图4a可知，反应前各体系乳化活性（平均为35.65±1.45 m2/g）差异性不显著，而相较初始体系，经美拉德反应2.5 h的体系乳化活性稍有提高，其中比例为1:3的体系乳化活性最好（乳化活性指数为40.18±1.12 m2/g），比例为1:1的体系乳化活性最差（乳化活性指数为35.80±0.15 m2/g），但与之相反的是，WPI 经热处理后乳化性反而降低（34.10±0.75m 2 /g）。 由图4b可知，反应前各体系的乳化稳定性范围为60.06±0.88~42.30±5.88 m2/g，其中低聚木糖-WPI比例为1:1时乳化稳定性最大，比例为1:3时最小，这可能是多糖含量不同造成的差异；而美拉德反应后各体系乳化稳定性均增加，比例为1:2的乳化稳定性最好（65.23%），比例为1:3时最差（56.85%），同时热处理后的WPI乳化稳定性也降低（41.64%±0.77%）。
（5）低聚木糖-WPI美拉德反应产物的流变学性质 如图5所示，WPI及4种比例低聚木糖-WPI美拉德反应产物的储能模量G'和损耗模量G''随温度和时间的变化曲线。 由图5a可知，当升温温度在25.80~55.29℃时，WPI溶液G''>G'，表现为流体特征，即溶胶状态；当温度在55.78℃时，WPI溶液开始出现G'>G''，在88.64℃时G'的急剧增大，说明在这个阶段发生了溶液-凝胶的转变，同时在初始的温度上升阶段（温度范围约为25~88.64℃），G'和 G''的值都非常小（<1 Pa）。随后G'始终大于 G''，在90℃下保持30 min期间，可能是热诱导更多的蛋白质分子聚集，WPI凝胶网络增强，从而提高了升温初始形成的弱凝胶弹性。随着温度从90℃降至25℃，G'进一步增大，最终达到13000 Pa以上，这种现象表明胶体网络强度在冷却过程中逐渐增强，这可能是由于变性蛋白质之间形成了额外的非共价相互作用（如凝胶结构中的分子间氢键、范德华力）；在接下来的25℃平衡期间，G'和 G''几乎没有进一步的改变，保持相对平行，说明此时已经形成稳定的蛋白质凝胶网络结构。 不同比例的低聚木糖-WPI美拉德反应产物溶液体系的模量随温度和时间的变化与 WPI的凝胶形成过程有所不同。在升温阶段中（25~90℃），G'和G''的变化较小，并且该值均小于10 Pa。在90℃下加热后才观察到MRPs溶液G'和G''显着增加，相比WPI曲线（125 s、88.64℃时开始急剧增大）MRPs溶液G'和G''显著增加的时间和温度均出现延迟（比例为 1:1、1:2、1:3、1:4 的体系分别在 147 s、154 s、167 s、129s），这种现象可能与低聚木糖的附着导致蛋白质变性温度升高有关。另一方面，G'和 G''在冷却过程中继续增加，在接下来的 25℃平衡期间G'和 G''值逐渐变得稳定，其中比例为1:3的体系G'值高达约 97000Pa（约WPI的7倍），其次是1:2的G'值约为38000 Pa，1:4和1:1的G'值分别为 18000 Pa和13000 Pa。同时整个升温和降温过程，G'始终大于G''，表明低聚木糖-WPI美拉德反应产物体系可能在25℃之前就表现出类固体性质。 如图6所示，分别为WPI和4种比例低聚木糖-WPI美拉德反应产物溶液的流动行为，数据显示了溶液的表观粘度随剪切速率的变化情况。在0.1~100 s-1的剪切速率范围内，剪切速率不断升高，5种体系表观粘度不断降低，表现出剪切稀化行为，呈现出一种典型的假塑性流体流变特性。此外，在相同剪切速率下，WPI的表观粘度最小；虽然美拉德反应使得体系表观粘度增加，但体系中WPI所占比例越大，其假塑性特征越明显；随着WPI占比的降低，剪切速率不断增大，表观粘度下降逐渐减小。
试验结论 低聚木糖-WPI质量比为1:2时，体系美拉德反应程度最高，平均粒径最大，乳化活性和乳化稳定性也得到最大程度的提高。此外，本实验研究了糖基化修饰对WPI凝胶行为的影响，发现美拉德反应导致了各体系模量不同程度的增加，其中比例为1:3的低聚木糖-WPI美拉德反应产物的粘弹性最强，G'值约为原始WPI的7倍，结果证明美拉德反应可改善WPI的乳化特性和凝胶特性。
参考资料： 廖阳, 胡居吾, 马永花, 熊华, 赵强. 湿热条件下低聚木糖-乳清分离蛋白的美拉德反应及产物乳化性与流变性研究[J].现代食品科技,2019,35（12）:20-27+111. |
