试验设计

 微胶囊的制备：以海藻酸钠、乳清蛋白为壁材，采用挤压法制备微胶囊，具体方法如下：

 将双歧杆菌接种MRS液体培养基，于37℃厌氧培养24 h，连续活化3次后，离心(5000 r/min, 5 min)收集菌泥，用 0.9%生理盐水洗涤两次后，重悬于生理盐水中，使得浓缩菌液维持在10⁹ CFU/mL，采用倾注平板法对浓缩菌液进行计数。取一定量的浓缩菌液，加入冻干保护剂，与2%海藻酸钠和10%的乳清蛋白按1：1：1 比例混匀成菌悬液，磁力搅拌30 min。采用1mL 注射器逐滴加入2%的氯化钙中，静置30 min，生理盐水洗涤3次，得湿胶囊，将样品在-80℃中预冻1 h后，于冷冻干燥机中冻干24 h，得冻干微胶囊。在浓缩菌液中，加入等量保护剂直接冷冻干燥后，得冻干菌粉。

 含低聚木糖复配冻干保护剂的设计：

 单因素试验：低聚木糖添加量的筛选：分别按照浓缩菌液的0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%加入低聚木糖，充分混匀后进行制备冻干微胶囊，并测定其包埋率、冻干存活率和最终活菌载率。

 甘油添加量的筛选：在最佳低聚木糖含量的基础上，分别加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的甘油于浓缩菌液中，充分混匀后制备微胶囊，并测定其包埋率、冻干存活率和最终活菌载率。

 谷氨酸钠添加量的筛选：在最佳低聚木糖含量的基础上，分别加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的谷氨酸钠于浓缩菌液中，充分混匀后制备微胶囊，并测定其包埋率、冻干存活率和最终活菌载率。

 正交试验：在单因素试验的基础上，按表1进行正交试验，以双歧杆菌最终活菌载率为考察指标，确定复配保护剂的最佳配比。

       包埋率、冻干存活率和最终活菌载率计算：取1 g 湿(冻干)微胶囊于锥形瓶中，加入10 mL无菌PBS缓冲液（pH=7.4），于37℃振荡1 h，用0.9%灭菌生理盐水进行梯度稀释, 使用倾注平板法进行精确计数。包埋率、冻干存活率以及最终活菌载率计算公式如下：

       式中N₀:原菌悬液总的活菌数(CFU)；N₁:湿胶囊中总的活菌数(CFU)，每克湿胶囊中的活菌量乘以总的湿胶囊质量；N₂:冻干微胶囊中总的活菌数(CFU) ，每克冻干胶囊中的活菌量乘以总的冻干胶囊质量。

 微胶囊的扫描电子显微镜分析：用JSM-6490LV仪器拍摄双歧杆菌微胶囊扫描电子显微照片，以未添加复配保护剂的微胶囊为对照。

 微胶囊在模拟胃液中的耐酸试验：模拟胃液配制：将8.5 g的NaCl和3.0 g的胃蛋白酶悬浮在7.0 mL的浓HCl中，并用蒸馏水稀释至1 L，使得溶液pH为2.0。分别取1 g添加保护剂和未添加保护剂的微胶囊置于锥形瓶中，并加入10 mL的模拟胃液，于37℃下振荡2 h，分别在0、10、30 min、1、2 h 取样离心(5000 r/min,5 min)收集微胶囊，并加入10 mL的无菌PBS缓冲液（pH=7.4），于37℃下振荡1 h, 使用倾注平板法进行精确计数，以初始微胶囊中的活菌数为基准，计算其存活率，其中以双歧杆菌冻干菌粉为对照。

 微胶囊在模拟肠液中的释放试验：模拟肠液的配制：取6.8 g的KH₂PO₄和10 g的胰蛋白酶溶于适量的蒸馏水中，用1 mol/L NaOH将pH调至7.5±0.1后，稀释至1 L备用。分别取1 g添加及未添加冷冻保护剂的微胶囊置于锥形瓶中，随后加入10 mL的模拟肠液，于37℃恒温振荡器中振荡培养3 h，依次在20、40 min、1、2、3 h 取样，使用倾注平板法进行精确计数，以最大活菌释放量为基准，计算其释放率，其中以双歧杆菌冻干菌粉为对照。

微胶囊贮存稳定性试验：将添加及未添加保护剂的冻干微胶囊分别在4℃和25℃下避光贮存35 d，每隔7 d取1 g样品，加入10 mL的无菌PBS缓冲液，于37℃下振荡1 h，使用倾注平板法测定双歧杆菌活菌数，其中以双歧杆菌冻干菌粉为对照。

试验结果

（1）单因素实验结果

低聚木糖添加量对冻干微胶囊活菌载率的影响

 如图1所示，在一定范围内，低聚木糖可以显著提高微胶囊的活菌载率，在质量分数为4%时，达到最大，为63.4%。适量的低聚木糖加入可以同时提高微胶囊的包埋效果和双歧杆菌的抗冻性；然而当低聚木糖添加量超过4%时，微胶囊的最终活菌载率逐渐降低；因此选择2%~6%的低聚木糖添加量进行后续正交试验。

甘油添加量对冻干微胶囊活菌载率的影响

 如图2所示，保持低聚木糖添加量为4%，随着甘油量的增加，微胶囊的活菌载率先增高后降低，在添加量为2%时，达到最大值，为67.5%；但过多甘油加入，会使得微胶囊的包埋效果降低，从而减少微胶囊的最终活菌载率；因此选择1%~3%的甘油添加量进行后续正交试验。

谷氨酸钠添加量对冻干微胶囊活菌载率的影响

 如图3所示，保持低聚木糖添加量为4%，当谷氨酸钠添加量为1%时，谷氨酸钠可以显著增强微胶囊的活菌载率；但过多的谷氨酸钠会导致单位质量微胶囊中菌含量减少，降低微胶囊的包埋率，同时谷氨酸钠浓度过高也会造成胞内渗透压增加，不利于低温保存。因此，当继续增加谷氨酸钠时，微胶囊的最终活菌载率逐渐降低；因此为进一步研究谷氨酸钠在复配保护剂中的协同效果，选择1%~3%的谷氨酸钠添加量进行后续正交试验。

（2）正交试验结果

 由表2和表3可知，影响微胶囊最终活菌量的因素主要次序是低聚木糖＞谷氨酸钠＞甘油，其中低聚木糖的P值小于0.05，说明低聚木糖含量对微胶囊的最终活菌载量具有显著性影响。根据K值，确定最佳配方为A₂B₂C₁，即低聚木糖4.0%，甘油2.0%，谷氨酸钠1.0%。经验证，最佳配方下的双歧杆菌微胶囊包埋率81.5%±0.7%，冻干存活率为88.1%±0.3%。 此时微胶囊的最终活菌负载率为71.8%±0.2%，优于正交试验表中的结果，因此认为正交试验优化结果有效。

（3）微胶囊的表观形态分析

 如图4所示，微胶囊粒径大小约为1 mm左右，表面呈皱缩塌陷，凹凸不平的现象。添加4%低聚木糖保护剂的微胶囊（图 b）相对于对照组（图 a），表面孔径较少，没有明显的裂缝。由于复配保护剂的冻干保护效果更佳，可以更有效的减缓冻干过程中冰晶的升华，因此添加复配保护剂的微胶囊（图 c）更加圆润包满，且表面平整致密。

（4）微胶囊在模拟胃液中的耐酸性能

 如图5所示，未包埋的益生菌粉经模拟胃液处理2 h后，菌体几乎全部死亡，而经包埋的益生菌下降了49.4%，说明益生菌微胶囊化可以有效抵抗胃酸等不良环境。此外，添加复配保护剂的微胶囊经模拟胃液处理2 h后，其活菌数只下降了34.1%，说明保护剂可以提高双歧杆菌微胶囊的耐酸性。此外，谷氨酸钠的添加也会诱导某些与菌体生物膜及信号转导有关的蛋白表达发生改变, 从而有利于在在酸性环境中生存。

（5）微胶囊在模拟肠液中的释放性能

 如图6所示，经包埋的益生菌微胶囊具有一定缓释作用，在60 min几乎全部释放，其活菌数约10⁸ CFU/mL，其中添加含低聚木糖复配保护剂的微胶囊在前60 min的释放量高于未添加的微胶囊；原因可能是添加复配保护剂的微胶囊，活菌载量更高，而且低聚木糖作为功能性益生元，可以充当营养物质刺激促进双歧杆菌的生长。因此添加复配保护剂的微胶囊能够较好地在人工肠液中崩解，并且达到益生元和益生菌的协同作用。

（6）微胶囊的储存性能

 由图7和图8可知，在4℃和25℃贮藏一定时间后，经微胶囊化的益生菌存活率显著高于冻干菌粉(P＜0.05)，说明微胶囊技术提高了双歧杆菌的储存稳定性。微胶囊壁材可以作为物理屏障，阻隔空气中氧和水分等不良因素，增强双歧杆菌的抵抗能力。添加低聚木糖复配剂的微胶囊，在4℃和25℃下贮藏35 d后，活菌量分别为8.1和7.0 lg CFU/g，相对未添加保护剂的微胶囊储藏性更好，且符合《益生菌类保健食品申报与审评规定(试行)》，原因可能是复配保护剂中低聚木糖和谷氨酸钠具有一定还原性，可以更有效减少菌体细胞膜脂质的氧化, 维持双歧杆菌的稳定性。

试验结论

 以海藻酸钠和乳清蛋白为壁材制备的双歧杆菌微胶囊中，添加以低聚木糖复配的冻干保护剂可以提高冻干微胶囊的活菌载率，最佳配方为低聚木糖4.0%、甘油2.0%、谷氨酸钠1.0%，此时微胶囊的活菌载率为 71.8%±0.2%，与未添加组相比提高了约 21.6%；添加以低聚木糖复配保护剂的微胶囊表面更佳平整致密，经模拟胃液处理2 h 后，活菌量相对于对照组提高了约15.3%，同时在肠液中前60 min的释放率也显著高于未添加组。经 4℃和25℃储藏35 d后, 加入保护剂的微胶囊活菌量相比与未添加组分别提高了约0.41 lg CFU/g和0.42 lg CFU/g。因此，低聚木糖复配保护剂可以提高双歧杆菌微胶囊的胃液耐酸性、肠液释放性和储藏稳定性。

参考资料：

张传伟,朱慧霞,柴佳太,彭洪草,姚日生.低聚木糖复配冻干保护剂的优化及其对双歧杆菌微胶囊性能的影响[J/OL].食品工业科技:1-13.