试验目的

本试验旨在研究XOS对氧化鱼油(OFO)引起的蛋鸡肠道黏膜屏障损伤和微生物菌群失调的缓解作用。

试验设计

选取50周龄海兰褐蛋鸡384只，随机分为4组，每组8个重复(以相邻4个笼子中的12只鸡作为一个重复)。在所有的重复中，蛋鸡的初始体重和产蛋量相近。新鲜鱼油组（FFO组）饲喂添加20 g/kg新鲜鱼油的饲粮；氧化鱼油组（OFO组）饲粮中添加20 g/kg氧化鱼油；OFO/XOS₂₀₀组，饲粮中添加20 g/kg氧化鱼油和200 mg/kg XOS；OFO/XOS₄₀₀组饲粮中添加20 g/kg氧化鱼油和400 mg/kg XOS。

氧化鱼油的制备方法是：新鲜鱼油（FFO）在90℃下加热并充分曝气72 h。新鲜鱼油和氧化鱼油的过氧化值分别为3.20和22.25 meq/kg。低聚木糖（XOS 95P）纯度95%。以等量替代玉米的方式在饲料中添加XOS。试验饲粮的成分见表1。

实时荧光定量PCR分析的目的基因[紧密连接蛋白-2(ZO2)，紧密连接蛋白1抗体(CLDN1)，紧密连接蛋白5抗体(CLDN5)]和β-肌动蛋白（β-actin）的引物序列如表2所示。

试验结果

（1）生产性能

整个试验期间没有蛋鸡死亡。如表3所示，在试验的第7~12周，OFO组的产蛋量（EP）较低(P<0.05)，且在第7~12周和第1~12周，OFO组的饲料转化率（FCR）较FFO组低(P<0.10)。而在第7~12周和第1~12周，FFO组、OFO/XOS₂₀₀组和OFO/XOS₄₀₀组的EP和FCR均无显著差异(P>0.05)。受鸡舍温度影响，所有蛋鸡前6周产蛋量均低于后6周。

（2）回肠的形态

饲喂试验饲粮的蛋鸡回肠形态见表4。FFO组与OFO组回肠绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD）、绒毛高度与窝深之比（VCR）、杯状细胞数（GCN）无显著差异(P>0.05)。OFO/XOS₄₀₀组回肠VH、VCR和GCN均高于其他组(P<0.05)。

（3）回肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和血清内毒素的浓度

第12周时蛋鸡回肠黏膜sIgA含量如图1A所示。与FFO组相比，OFO和OFO/XOS₂₀₀组蛋鸡回肠黏膜sIgA含量显著降低(P<0.05)，但OFO/XOS₄₀₀组比OFO组高(P<0.05)。如图1B所示，添加400 mg/kg XOS可降低氧化鱼油饲粮引起的血清内毒素浓度升高(P<0.05)，FFO组与OFO/XOS₄₀₀组间无显著差异(P>0.05)。

（4）紧密连接蛋白的相对mRNA表达

如图1C所示，与FFO组相比，OFO组各层回肠黏膜紧密连接蛋白1抗体(CLDN1)和紧密连接蛋白5抗体(CLDN5)的相对表达量降低(P<0.05)；然而，与OFO组相比，OFO/XOS₄₀₀组的相对表达均有所增加(P<0.05)。

（5）肠道菌群的多样性

如图2所示，采用Shannon、Simpson、Ace和Chao多样性和丰富度指数对盲肠菌群细菌alpha多样性进行了估算。3组间Shannon和Simpson指数差异无统计学意义(P>0.05)。添加XOS(400mg/kg)提高了饲喂氧化鱼油的蛋鸡盲肠微生物区系Ace(P=0.028)和Chao(P=0.084)指数。如图3A，基于未加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)显示，3组间的微生物群落分离(PCo1，15.88%；PCo2，13.73%)。如图3B，偏最小二乘判别分析(PLS-DA)图还定义了不同组的样本占据不同位置的组(COMP1，11.29%；COMP2，6.44%)。

（6）肠道菌群组成

采用RDA分类器在不同水平上分析盲肠菌群的分类组成。如图4A所示，所有类群的优势门均为拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)，其占整个门的比例大于88%。与FFO组相比，饲喂OFO的蛋鸡中拟杆菌门丰度较高，厚壁菌门丰度较低。然而，添加XOS逆转了OFO组的这些变化。

如图4B所示，在厚壁菌门中，大部分属于梭菌纲（Clostridia）、杆菌纲（Bacilli）和革兰氏阴性菌纲（Negativicutes）。

如图4C所示，在科水平上，蛋鸡盲肠菌群以拟杆菌科（Bacteroidaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）占优势。与FFO组相比，OFO处理降低了疣微菌科（Ruminococcaceae）丰度，理研菌科（Rikenellaceae）丰度增加，而饲粮中添加XOS则在一定程度上提高了疣微菌科丰度。

如图4D所示，属水平分析表明，拟杆菌属（Bacteroides）和理研菌科_RC9_gut_group（Rikenellaceae_RC9_gut_group）在群落中所占比例最大。理研菌科_RC9_gut_group的丰度在加入OFO的层中增加，而在加入XOS的层中降低。

利用LEfSe分析从门到属的水平上鉴定整个微生物群显著差异丰富的OTU(LDA>2.0)。如图5所示，FFO组盲肠菌群中均富集了链球菌科(链球菌属)、丁酸球菌属（Butyricicoccus）、瘤胃梭菌属_5（Ruminiclostridium_5）以及迷踪菌门(Elusimicrobia)及其衍生物(Elusimicrobibia， Elusimicrobiales，Elusimicrobiaceae，Elusimicrobium)。OFO组鸡的消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、丁酸弧菌属（Butyricimonas）和多形性粪球菌（Faecalicoccus）的丰度均增加。

在OFO/XOS₄₀₀组中，LEfSe突出显示大量富集于盲肠的细菌成员，其中一些细菌占了更大的比例，LDA评分更高，如疣微菌门（Verrucomicrobia）及其衍生物(疣微菌纲（Verrucomicrobiae），疣微菌目（Verrucomicrobiales）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）、阿克曼菌属（Akkermansia）)以及帕拉普雷沃特氏菌属（Paraprevotella），普氏菌属_9（Prevotella_9），颤螺旋菌属（Oscillospira）。

如表5所示，进一步采用威尔科克森秩和检验揭示微生物组成的差异。与FFO组比较，OFO组鸡的盲肠微生物区系疣微菌门(阿克曼菌属)、迷踪菌门(Elusimicrobium)和疣微菌科_UCG-008（Ruminococcaceae_UCG-008）的丰度较低(P<0.05)。此外，OFO处理组的梭杆菌门（Fusobacteria）丰度高于FFO组(P<0.05)。

添加XOS后疣微菌门(疣微菌科，阿克曼菌属)、帕拉普雷沃特氏菌属（Paraprevotella）、颤螺旋菌属（Oscillospira）和疣微菌科_UCG-013（Ruminococcaceae_UCG-013）的丰度有所升高(P<0.05)，而丹毒梭菌（Erysipelatoclostridium）的丰度较OFO组有所降低(P<0.05)。

（7）系统类型与表型的相关性

采用Pearson相关分析方法分析蛋鸡盲肠菌群系统类型与表型之间的关系。如图6A所示，疣微菌门（Verrucomicrobia）的丰度与回肠绒毛高度（VH）及回肠黏膜紧密连接蛋白1抗体（CLDN1）的表达呈正相关(P<0.05)。梭杆菌门（Fusobacteria）丰度与回肠绒隐比（VCR）及回肠黏膜分泌性免疫球蛋白A（sIgA）含量呈负相关(P<0.05)。迷踪菌门（Elusimicrobia）与CLDN1(P<0.05)、紧密连接蛋白5抗体（CLDN5）表达呈显著正相关(P<0.01)，与血清内毒素浓度呈显著负相关(P<0.05)。

如图6B所示，在盲肠菌群属水平上，丹毒梭菌（Erysipelatoclostridium）、图灵杆菌（Turicibacter）和消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）的一个未分类成员的丰度与回肠VH、VCR、杯状细胞数（GCN）、sIgA浓度，以及回肠黏膜紧密连接蛋白-2（ZO2）、CLDAN1、CLDN5的表达呈负相关(P<0.05)。相反，颤螺旋菌属（Oscillospira）、帕拉普雷沃特氏菌属（Paraprevotella）和疣微菌科_UCG-008（R.UCG-008）的丰度与回肠VH和/或GCN呈正相关(P<0.05)。此外，阿克曼菌属（Akkermansia）的相对丰度也与回肠VH、ZO2和CLDN1的表达呈正相关(P<0.05)，而丁酸弧菌属（Butyricimonas）与回肠黏膜CLDN1、CLDN5的表达及sIgA浓度呈负相关(P<0.05)。Elusimicrobium丰度与回肠黏膜CLDN1(P<0.05)和CLDN5表达呈显著正相关(P<0.01)，与血清内毒素含量呈显著负相关(P<0.05)。

结论

添加XOS可减轻OFO对蛋鸡生产性能的损害，并通过缓解肠道黏膜屏障功能障碍强化回肠形态，这可能与增加微生物丰富度和重塑微生物组成有关。本研究将拓展我们对肠道微生物在通过膳食干预调节肠道黏膜屏障中的作用的认识，有助于提高XOS在鸡肉生产中的应用效率。

参考文献：

Jian-Min Zhou, Hai-Jun Zhang, Shu-Geng Wu, Kai Qiu, Yu Fu, Guang-Hai Qi, Jing Wang.Supplemental Xylooligosaccharide Modulates Intestinal Mucosal Barrier and Cecal Microbiota in Laying Hens Fed Oxidized Fish Oil[J].Frontiers in microbiology,2021,Vol.12: 635333.